三种不同引物扩增对猪圆环病毒2型检测敏感性的研究(2)
ORF2基因是决定PCV2的主要免疫原的基因，也是对其进行PCR鉴别诊断的首选基因[3]。根据GenBank已公布的ORF2序列，应用Primer Premier 5.0引物设计软件可以设计扩增引物进行PCR检测，但不同的PCR方法所分析的基因序列区间及检测用引物、扩增片段大小各不相同，特异性和敏感性不一，有时会因病毒污染的程度小而检测不出抗原。为了避免假阴性情况的发生，应根据实际情况选择特异性强、敏感度高的扩增引物。
目前，生产实践中常用的猪圆环病毒PCR方法检测引物有：国家标准引物，有3条，采用多重PCR方法，可以区分PCV1与PCV2[4]；出入境检验检疫标准引物，有4条，所用方法为巢式PCR，可以区分PCV1与PCV2[5]。本实验拟自主设计一对引物，应用普通PCR方法检测猪圆环病毒2型，并与国家标准引物、出入境检验检疫标准引物进行特异性、敏感性方面的对比验证，以筛选更理想的PCR引物，为疫苗质量监控过程中检测PCV2外源病毒的方法优化及临床快速诊断PCV的方法优化奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 主要仪器
CO2培养箱，购于Forma公司；荧光倒置显微镜，购于Olympus公司；PCR仪，购于Eppendorf公司；UV-2000紫外分析仪，购于上海嘉鹏科技有限公司；移液器，购于Eppendorf公司。
1．1．2 细胞和病毒
PK-15细胞由成都天邦生物制品有限公司研发部保存，PCV2临床株由成都天邦生物制品有限公司研发部分离鉴定并保存，PCV2大北农株（灭活疫苗用DBN-SX07 株）购于北京大北农集团。
1．1．3 酶和试剂
2×Taq PCR MasterMix为Takara公司产品，DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit）为天根公司产品，Goldview为赛百盛公司产品，细胞培养液为含10%新生牛血清（NCS）的DMEM溶液，PCV2阳性血清由成都天邦生物制品有限公司研发部制备保存，兔抗猪荧光二抗购于Sigma公司，其余试剂均为分析纯产品。
1．1．4 引物
国标引物为3条，扩增目的片段大小为1154bp；出入境引物为4条，扩增目的片段大小为260bp；研发引物针对PCV2标准毒株ORF2基因设计，扩增目的片段大小为727bp。引物均由大连TaKaRa公司合成，引物序列和扩增片段大小见表1。
表1 PCR引物序列及其扩增片段大小
Table 1 The sequences of PCR primers and the lengths of their amplified fragments
种类 名称 引物序列 长度 扩增片段大小
PCV国家标准引物 P1 5´-CCG CGG GCT GGC TGA ACT T-3´ 19 PCV1 652 bp
PVC2 1154 bp
P2 5´-CTC GGC TAT GCG CTC CAA AAT G-3´ 22
P3 5´-ACC CCC GCC ACC GCT ACC-3´ 18
PCV出入境检验检疫标准引物
nP1 5´-CAA CTG CTG TCC CAG CTG TAG-3´
21 880 bp
nP2 5´-AGG AGG CGT TAC CGC AGA G-3´ 20
nP3 5´-TAG GTT AGG GCT GTG GCC TT-3´ 20 260 bp
nP4 5´-CCG CAC CTT CGG ATA TAC TG-3´ 20
PCV研发引物
Y1 5´-GCC CGT GCC ACA TCG AGA AA-3´
20 727 bp
Y2 5´-GGG GGG GAA AGG GTG ACG AAC T-3´ 22
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