三种不同引物扩增对猪圆环病毒2型检测敏感性的研究(3)
1．2 方法
1．2 .1 病毒TCID50的测定
采用常规微量法培养PCV2临床株和PCV2大北农株[5]，并通过间接免疫荧光试验测定其TCID50[6]-[7]。
以下操作在超净台或生物安全柜中进行：
将PK-15细胞(无PCV1污染)接种于96孔板中，置于37℃、5%CO2 条件下培养约24h，于显微镜下观察，发现单层细胞铺满孔壁即可；吸取2mL无菌DMEM溶液将病毒冻干粉溶解，并做10-1~10-10连续稀释；按稀释度分别接种于96孔细胞培养板上的PK-15单层细胞，每个稀释度做1列（8个细胞孔），设2孔阴性对照（正常的PK-15细胞），置于37℃、5%CO2 条件下培养；约48 h后取出细胞板，倾去其中液体，用无菌PBS洗涤3次，每次5min，再用预冷的甲醇固定20 min；弃去固定液,将96孔板自然晾干，再用无菌PBS洗涤3次，每次5min,自然干燥；将制备的猪源猪圆环病毒2型阳性血清按1 : 1000稀释，分别取50μL加入每孔，37℃水浴1h，用无菌PBS洗涤3次，每次5 min，拍干；将吹冰根过氧化物酶标记的兔抗猪二抗按1:200稀释，分别取50μL加入每孔，37℃水浴45min，用无菌PBS洗涤3次，每次5min，拍干，置于荧光倒置显微镜下观察；按Reed -Muench法计算毒株的TCID50。
1．2 .2 病毒DNA的提取
取2mL无菌DMEM溶液将病毒冻干粉溶解，并作10-1~10-12连续稀释，分别提取DNA：吸取150μL病毒液于1.5mL的EP管中，加入缓冲液GA补足200μL，震荡至彻底混匀；吸取20μL蛋白酶K溶液加入EP管，震荡混匀；吸取200μL缓冲液GB加入EP管，充分颠倒混匀，于70℃放置10min，待溶液变清亮时，瞬时离心除去管内壁水珠；吸取200μL无水乙醇加入EP管，充分震荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀；将上述所得溶液和沉淀都转移至一个新的吸附柱CB3中，离心（12000rpm，30s），弃废液，吸附柱放回收集管；向吸附柱CB3内加入500μL缓冲液GD，离心（12000rpm，30s），弃废液，吸附柱放回收集管；向吸附柱CB3内加入700μL漂洗液PW，离心（12000rpm，30s），弃废液，吸附柱放回收集管；再加入500μL漂洗液PW重复洗涤一次，并空离心（12000rpm，2min），将吸附柱于室温下放置数分钟，以彻底晾干残余液体；将吸附柱CB3置于新的离心管中，向吸附柱中心部位悬空加入50~200μL洗脱液TE或双蒸水，室温放置2~5min，离心（12000rpm，2min），收集溶液。
提取到的病毒DNA置于-20℃保存备用。
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