过表达Circ-AKT2细胞系构建及Circ-AKT2功能初步研究(2)
2.1流感病毒A/PR8/34(H1N1)毒株的血凝价测定 9
2.2流感病毒A/PR8/34(H1N1)毒株TCID50的测定结果 10
2.3检测circ-AKT2在PR8感染后2-16h表达水平 10
2.4扩增circ-AKT2全长 10
2.5 PCDH-circ-AKT2过表达载体的构建及验证 10
2.6检测circ-AKT2过表达水平 11
2.7 Circ-AKT2-293T及Circ-AKT2-A549稳定细胞系构建及验证 11
3 讨论 12
致 谢 13
参考文献 13
过表达Circ-AKT2细胞系构建及 Circ-AKT2功能初步研究
circRNAs是一种广泛存在于哺乳动物细胞中具有共价闭合环状结构的RNA分子，并没有线性RNA的5’端帽子和3’端polyA尾的结构[1]。20世纪70年代，circRNAs首次在RNA病毒中发现[2]，随后人们又在酵母的线粒体中发现了新的circRNAs[3]。1993年，研究人员在人类细胞中也发现了一些由外显子构成的circRNAs[4]。由于它们表达量低，曾被认为是侥幸形成的RNA分子或者是RNA异常剪接的产物，当时所确认的circRNAs数目也只有少数几种[5-11]，针对它们的研究并不深入。随着RNA测序技术和生物信息学的发展，最新的研究成果显示哺乳动物细胞中存在大量稳定且保守的circRNAs[12]。而对于circRNAs的产生，有研究者提出了两种模型：外显子跳跃模型（exon skipping）和直接反向剪接（direct backsplicing）模型[13]。目前的研究发现，circRNAs可以调节宿主基因表达，与RNA 结合蛋白相互作用调控翻译过程，发挥顺式转录调控作用[14]，甚至可以调控亲本基因的表达和可变剪接等过程[13]等。
蛋白激酶B(proteinkinaseB，PKB)也被称为丝/苏氨酸蛋白激酶(serine-threoninekinase，Akt)，它处于多条信号通路的重要交叉点，通过影响下游多种因子的活化状态，发挥着关键的生物学作用。丝/苏氨酸蛋白激酶参与调控细胞存活主要通过控制代谢方式、调节转录因子、直接调控凋亡蛋白三种方式来实现。近年来，人们通过对Akt生物学作用的不断研究，其分子特性及作用靶点逐步被阐明，发现它在细胞凋亡、增殖、血管再生、新陈代谢、细胞迁移中也起的作用也有了重大突破。AKT基因是否形成circRNA，以及是否对其他基因及蛋白是否有调控作用，目前仍无报道。
流感病毒至今仍是威胁人类和动物生命安全的病原体之一，其中流行范围最广、危害最严重的为甲型流感病毒。在分类上，甲型流感病毒(Influenza A virus, IAV)属于正黏病毒科流感病毒属。依据血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)在抗原性上的不同，甲型流感病毒又可进一步分为18个HA亚型和11个NA亚型[15]。关于miRNA调控流感病毒在细胞中增殖的报道层出不穷，而具有miRNA“海绵”作用的circRNA能否在miRNA调控流感病毒在细胞中增殖起“开关”作用还未曾报道。
慢病毒（Lentivirus）载体是由人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础经过改造和优化而逐渐发展起来的基因治疗载体[16]，具有转染效率高，安全性高，可以在体内较长期的表达等特点。慢病毒中多个和病毒活性相关的序列结构已经被剔除，并被外源性目的基因所取代，使其具有较高的生物学安全性[17]。慢病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，生物安全性高。HIV-1型慢病毒载体系统目前被广泛使用的是三质粒系统和四质粒系统。第三代质粒系统去除了HIV病毒所有辅助蛋白对应的基因序列，HIV原有的9个基因保留只保留gag、pol、rev三个于构建的慢病毒载体中，降低了体系意外重组的可能性。利用慢病毒载体构建circ-AKT2过表达细胞系，便于探究circ-AKT2在宿主遭遇流感侵袭时所发挥的功能，更有利于阐明circ-AKT2的功能和相关机制的研究。