过表达Circ-AKT2细胞系构建及Circ-AKT2功能初步研究(3)
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞和试剂 293T细胞、A549细胞、DMEM细胞培养基、胎牛血清、Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit K1621、RNA isolater Total RNA Extraction Reagent (Trizol总RNA提取)、Axygen DNA Gel Extraction Kit （DNA凝胶回收试剂盒）、DNA ladder marker、琼脂糖、限制性内切酶、Taq polymerase、dNTP、Primer、E.Z.N.A. ® Endo-free Plasmid Mini Kit去内毒素质粒抽提试剂盒、Lipofectamine2000转染试剂、ExFect Transfection Reagent（Vazyme细胞转染试剂）
1.1.2 主要仪器 PCR仪、稳定DNA电泳仪、凝胶成像仪、细菌摇床、细菌培养箱、移液器、高速离心机、细胞培养箱、生物安全柜、荧光倒置显微镜
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
1.2.1.1 HEK293T细胞培养 293T细胞长到90%左右进行传代，吸掉293T细胞培养瓶内的培养液。吸取适量的无Ca 2+和 Mg 2+的PBS, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍。加少量的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA (一般25cm2的培养瓶加1ml,75cm2的培养瓶加2~3 ml),放到培养箱温育20 s即可。细胞消化完毕, 加适量培养液终止消化, 并吹打细胞, 制成均匀的细胞悬液，加足量的培养液，分装到新的培养瓶中。
1.2.1.2 A549细胞培养 A549细胞长到90%左右进行传代，吸掉A549细胞培养瓶内的培养液。吸取适量的无Ca 2+和 Mg 2+的PBS, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍。加少量的 0.05% 胰蛋白酶 -EDTA (一般 25cm2的培养瓶加1 ml, 75 cm2的培养瓶加2~3 ml)，放到培养箱温育3min左右即可。细胞消化完毕后, 加适量培养液终止消化, 并吹打细胞, 制成均匀的细胞悬液，加足量的培养液，分装到新的培养瓶中。
1.2.2 HA效价和TCID50的测定
1.2.2.1 HA效价测定 向血凝板各孔中加入50μl的PBS，取50μl的病毒尿囊液从第1孔开始倍比稀释，依次稀释到第11孔弃掉50μl液体，第12孔不加病毒液为红细胞空白对照。向各孔中加入1%的鸡红细胞，轻微震荡混匀后静置15min即可读取结果。
1.2.2.2 TCID50测定 病毒按照倍比稀释方法，每个稀释度设8个重复，96孔板培养的MDCK细胞大约60~70%丰度，每孔约8000~10000个细胞，移去细胞上清，然后PBS洗涤3次，加上100μl病毒稀释液，37℃孵育2 h，移去上清，PBS洗涤3次，加入150µl含有TPCK处理过的胰酶的病毒文持液。三天后，显微镜下观察病变计数病变孔，通过Reed-Muench方法计算病毒滴度。
1.2.3 A549细胞接A/PR/8（H1N1)毒株 以MOI=10的剂量接A/PR/8（H1N1)毒株于之前所培养的A549细胞中，放入细胞培养箱37℃、5%CO2培养2h后用PBS溶液洗涤3次，随后使用细胞文持液（含2%FBS）继续培养细胞，每个处理设立3个重复，同时设立空白对照组（MOCK）。分别在2h、4h、6h、8h、10h、12h、16h获得不同时间点的细胞样品。
1.2.4 RNA提取 1)获得的不同时间点的细胞样品，每5~10╳106个细胞加1ml Trizol后，反复剧烈振荡或用枪吹打以充分裂解细胞。2)将接毒组和对照组的细胞样品TRIZOL裂解液转入2mlEP管中，在室温25℃下放置5分钟；在EP管中，按照每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，将EP管剧烈震荡15秒，在室温下放置2～3分钟后，12000rpm/min（4℃）离心15分钟。3)取上层水相置于新EP管中，按照每1mlTRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下放置10分钟，12000rpm/min（4℃）离心10分钟。4)按照每1mlTRIZOL加1ml 75%乙醇去除其中异丙醇，震荡混合，12000rpm/min（4℃）离心5分钟，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；用DEPC water或者Rnase-free water溶解RNA沉淀，并使用仪器对抽提得到的RNA纯度和含量进行检测。