过表达Circ-AKT2细胞系构建及Circ-AKT2功能初步研究(4)
1.2.5 RNA反转录
1.2.5.1 RNA产品用量 0.1 ng - 5μg的总RNA或者1 ng - 500 ng的poly(A) mRNA作为模板合成第一链cDNA。
1.2.5.2 RNA反转录 1）待各试剂融化后，将试剂盒中各组分混匀并离心，置于冰上待用。2）按照顺序将下面的反应物加入置于冰上的无菌无核酸酶的PCR管中。
模板 RNA 总RNA
或者poly(A) mRNA
或者特异性 RNA 0.1 ng - 5 μg
10 pg - 0.5 μg
0.01 pg - 0.5 μg
引物 oligo (dT)18引物
随机吹冰聚体引物
基因特异性引物 1 μl
1 μl
15-20 pmol
无核酸酶的高纯水 到12μl
总体积 12μl
3）将下列组分按照顺序加入
5X Reaction Buffer
RiboLock™ RNA酶抑制剂 (20 u/μl)
10 mM dNTP Mix 4 μl
1 μl
2 μl
RevertAid™ M-MuLV 逆转录酶(200 u/μl) 1 μl
总体积 20 μl
4）轻轻混匀，离心。5）如果使用基因特异型引物或oligo(dT)18引物，42°C孵育60分钟。如果使用随机吹冰聚体引物，25°C。先孵育5分钟，随后42°C孵育60分钟。
1.2.6 circ-AKT2检测
1.2.6.1 检测AKT可能存在的成环位点 设计circ-AKT2特异性扩增引物对circ-AKT2进行扩增，检测AKT可能存在的成环位点。
引物名称 引物序列（5’-3’）
AKT2-F GCTACTACGCCATGAAGATCC
AKT2-R GCCACTTCCATCTCCTCAGT
内参选用GAPDH基因并设计其特异性扩增引物
引物名称 引物序列（5’-3’）
GAPDH-F GTCAGCCGCATCTTCTTTTG
GAPDH-R GCGCCCAATACGACCAAATC
通过比较接毒的A549细胞及正常的A549细胞中circ-AKT2和内参基因GAPDH表达水平的相对差异，检测流感病毒侵袭细胞前后circ-AKT2的表达水平相对变化。
1.2.6.2 配制SYBR Green I实时定量PCR的反应体系
试剂 体积（µL）
ddH2O 7
2 × master mix 10
Primer（+）（10µM） 1
Primer（-）（10µM） 1
cDNA 1
总体积 20
每个反转录得到的cDNA样本分别配制两种反应体系，一种加circ-AKT2特异性扩增引物; 另一种加GAPDH 特异性扩增引物。
PCR扩增参数：94℃预变性3 min；94℃变性30 S，60℃退火30 S，72℃延伸30 S，共30个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
采用SYBR Green I法进行相对定量分析，对接毒组细胞样本和对照组细胞样本中的基因表达水平进行比较，确定A549细胞接毒A/PR/8（H1N1)毒株，circ-AKT2表达水平的相对改变。进行相对定量分析时，对样本中circ-AKT2的检测是建立在参比样本基础上的，将定量测定结果表示为接毒组和未接毒组内参GAPDH基因mRNA /circ-AKT2基因mRNA的比值。