巧克力微杆菌中酯酶的克隆表达及性质研究(3)
酯酶与脂肪酶的主要区别是它们底物选择性不同。酯酶只能水解较短链的可溶性酯底物，而脂肪酶除了可以水解短链的可溶性酯底物外，更为重要的是其还能水解不易溶于水的长链酯底物，尤其是长链脂肪酸甘油三酯。此外，大多数的脂肪酶都具有 “界面激活效应”，即当底物浓度超过饱和度时，脂肪酶的活力会有一个突然的提高；而酯酶则遵循典型的Michaelis-Menten动力学。
虽然二者的结构都是α/β折叠，但这种底物选择性的差异与二者在酶分子结构上的差异相关。通过对不同的酯酶和脂肪酶的晶体进行结构分析，发现至少有两个结构区域参与识别不同的底物：一是所谓的“盖子”（lid）或“帽子”（cap）结构域。脂肪酶的lid结构域较酯酶的cap结构域活动性更大，可以绕着连接lid结构域loop上的―铰链进行翻折。大多数研究者认为这个可翻折的盖子是界面激活效应的结构基础。酯酶结构中虽然有cap结构，但其固定于N末端，不易稳定地形成所谓的“翻折”结构。因而没有界面效应，也不能对长链脂肪酸底物产生作用。对于短链可溶性单酯类底物（如p-NP酯），由于分子构型比较小，完全可以通过分子表面孔隙进入活性中心完成催化。因此无论是酯酶还是脂肪酶都具有对该类底物较高的催化活性。因此，决定酯酶/脂肪酶活性差异的根本问题在于空间构型较大的甘油脂底物能否利用结构域的开关进入催化中心，进而完成催化反应。
催化酯水解按乙酰化反应和去乙酰化反应两步进行,经过两个过渡态，最终水解出两段肽产物。反应机制如下：
首先，Ser侧链上的氧将质子转移给His的N，然后攻击肽键的羰基碳（共价催化）；同时，His得到的质子与底物中的-NH形成氢键（酸碱催化）。这样，Ser-O-、底物的羰基C、底物的-NH以及His的咪唑H+形成了一个四联体过渡态。
接着，酯键断裂，羟基产物释放，底物的羧基部分通过酯键连接到Ser的羧基上。很快的，电荷中继网从附近水中吸收一个质子，由此产生的OH-攻击连接在Ser上底物的羧基碳，从而形成了Ser-O-、底物的羰基C、OH-以及His的咪唑H+形成了另一个四联体过渡态。
最后Ser得到一个质子，同时释放底物的酸部分。
在形成两个四联体过渡态时，氧阴离子洞 Gly-Gly 和 Ser主链上的NH 通过氢键稳定过渡态上带部分负电的羧基氧，这使得酶与底物过渡态的亲和力比较底物更高[1-7]。
图1.1丝氨酸水解酶催化机制图解
1.1.3 酯酶在合成中的其他应用
酯酶作为工业上重要的生物催化剂,已经越来越广泛地被研究。尤其是在合成手性化合物时,酯酶的立体选择性显得尤为重要。酯酶是研究比较早的一类酶。Michimasa用PscudomaonasP脂肪酶和猪胰脂肪酶(PPL)对2-苯-丙醇进行了拆分,反应是通过两种酶分别催化酯交换反应而进行,使得对映体拆分率分别提高到了39%和41%[14];Jianxin等人利用Pscudomaona.cepacia和脂肪酶拆分了一类酞基取代的1—环己烯衍生物,通过酶催化酯交换反应,得到了产率比较高的光学纯化合物[15,16];孙志浩等人筛选获得了高度立体专一性的D-泛解酸内酯酶,应用于泛解酸内酯的选择性水解,得到光学纯度为96%的D-泛酸,该方法已经在日本第一制药公司应用于工业化生产[17]。
1.2 基因工程简介
基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是指指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。