氯噻啉噬菌体展示酶免疫分析方法的研究(2)
2.7 HPLC验证 10
3.结论与讨论 10
致谢 11
参考文献 11
氯噻啉噬菌体展示酶免疫分析方法的研究
引言：氯噻啉是南通江山农药化工股份有限公司自主研发的新型烟碱类杀虫剂，广泛用于防治吮吸式口器害虫，如叶蝉、飞虱、蚜虫及其抗性品系，同时对鞘翅目、鳞翅目和双翅目害虫也有防效。由于其具有高效、广谱、低毒等优点，氯噻啉已被广泛使用。因此，研制氯噻啉快速、经济、灵敏度高、稳定性好和高通量的检测方法对保障农产品安全和环境安全具有重要的意义。目前，氯噻啉残留常用检测方法是高效液相色谱法（HPLC），但该方法样品前处理过程较繁琐，检测结果易受样品净化、浓缩等步骤的影响，不适合进行批量样品的快速检测。
免疫分析技术因为具有高灵敏度、高特异性、简便快速、分析成本低、分析容量大等优点，成为当前农产品质量安全领域的研发热点之一。对于化学农药这样的小分子化合物而言，由于其为单抗原决定簇分析物，整个分子只能和一个抗体结合，所以通常选择竞争模式来建立免疫分析方法。在竞争模式的免疫分析方法中，必须存在一个经过标记的竞争物，通常是将半抗原与蛋白、酶和荧光物等连接制备获得。
操作简单，敏感性高，特异性好，免疫测定技术已被广泛用于小分子化合物的检测，如农药，生物毒素，抗生素等[1,2]。小分子化合物不能被两种抗体同时识别结合，所以通常采用竞争模式检测。在竞争模式中，与分析物竞争结合抗体的竞争物（与载体蛋白或示踪物偶联的竞争半抗原）是不可缺少的材料[3]。许多研究表明，异源竞争物（竞争半抗原的结构与免疫半抗原不同）相对于同源竞争物（竞争半抗原的结构与免疫半抗原相同）可以显著提高免疫测定的灵敏度[4-6]。制备异源竞争物的常规方法是设计和合成异源半抗原，并与载体蛋白偶联。然而这种方法通常较为困难、昂贵，而且存在不确定性[5，7]。因此，一些分析物的异源竞争物并未获得。
噬菌体展示技术是一种快速制备异源竞争物方法，且可以显著提高敏感性。噬菌体展示技术的原理是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下,使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达, 融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性, 以利于靶标分子的识别和结合 [8]。目前，从噬菌体展示库中已经获得了很多异源竞争物，并比化学合成的同源和异源竞争半抗原表现出更高的敏感性[9-13]。Kim 等人建立了3-苯氧基苯甲酸的噬菌体酶免疫吸附分析（P-ELISA），与同源ELISA相比，敏感性增加100倍[3]。Wang等人开发了用于测定2,2'，4,4'-四溴二苯醚的P-ELISA，敏感性提高11倍[13]。虽然噬菌体展示技术提供了一种快速制备高质量的异源竞争物的途径，但是分析模式基本都为P-ELISA，线性范围相较于传统ELISA较窄。如苯噻菌酯[3]和黄曲霉毒素 [11]的P-ELISAs的线性范围分别是0.22 - 3.94 ng mL-1 和 0.09 - 0.5 ng mL-1，均窄于传统ELISA （0.428-54 ng mL-1 [19] 和 0.1-10 ng mL-1[14,15]）。在检测中，通常需要将高浓度样品稀释至检测范围用于定量分析，增加了操作步骤，且可能降低分析的精确度。
当在酶免疫分析中应用化学发光底物时，可以增强ELISA的敏感性和检测范围。基于吹冰根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）的化学发光酶免疫分析（CLEIAs）已广泛用于临床诊断和分析检测[16-19]。Fang 等人建立了用于分析黄曲霉毒素B1的化学发光酶免疫测定，与ELISA相比，线性范围增加了12倍以上[20]。Vashist等人开发了用于检测人白蛋白的化学发光免疫分析方法，线性范围扩大30倍[21]。
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