包埋法固定化大肠杆菌细胞的研究+文献综述(4)
本实验运用的腈水解酶的来源如下：
提取：从含有腈水解酶基因同时带有T7-l ac启动子载体的大肠杆菌DH5α菌株中提取质粒，并用1%琼脂糖凝胶电泳观察质粒大小。
转化：将上述提取出来的质粒转入宿主菌大肠杆菌BL21 (DE3)中，获得了重组菌。
1.2 细胞固定化的研究意义
细胞固定化技术，是利用物理或化学手段将游离的微生物(细胞)或酶，定位于限定的空间区域，并使其保持活性且能反复利用的一项技术。早在19世纪初叶，人们就利用微生物细胞在固体表面吸附的倾向而采用滴滤法来生产醋酸。1973年，日本首次在工业上成功地利用固定化微生物细胞连续生产L天冬氨酸。20世纪80年代，发达国家采用细胞固定化技术制作微生物接种剂接种土壤，并取得了一定的进展，国内学者也开始研究该领域。固定化细胞技术逐渐显示出其优越性，并受到广泛重视，很快从固定化休止细胞发展到固定化增殖细胞。至今，研究领域已经扩大到到各个生产菌种方面。固定化细胞的应用范围极广，目前已遍及工业、医学、制药、化学分析、环境保护、能源开发等多种领域。
与游离细胞相比，固定化细胞利于酶、底物和产物的分离，减少酶的活力损失，大大降低了成本；酶处于天然细胞的环境中，稳定性高，抗污染能力更强；易于进行辅助因子的再生，因而更适合于需要辅助因子的反应，如氧化还原反应和合成反应等[14]；优化了提取工艺，提高了产率，在短时间内酶可以多次使用，反应过程易于控制，有利于工艺的自动化生产，酶的使用率高，产量高。但是固定化降低了酶的活力，使酶和底物的传质阻力增加了。所以本实验的目的是优化反应条件，找出固定化的最适条件。
1.3 细胞固定化制备方法
固定方法是多种多样的，包括吸附法、包埋法、结合法、交联法以及后来出现的无载体固定法等。但是目前研究较多的是包埋法固定化技术，且其应用也比较成熟。
1.3.1 吸附法[15]
很多细胞都有吸附到固体物质表面，或其他细胞表面的能力，利用微生物细胞固有的吸附能力使细胞固定化。吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法，前者是使用具有高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、沸石，石英砂和纤文素等，吸附剂将细胞吸附到表面上使之固定化，这些载体既耐用又耐高压，适用于工业司的应用。有的微生物不具有吸附能力，可通过改变细胞或载体表面的物理性质使微生物细胞以离心引力或借助化学键吸附到载体上。后者根据细胞在解离状态下可因静电引力而固着于带有相异电荷的离子交换剂上。用木屑吸附细胞装填的固定化反应器来生产乙酸，是最早应用固定化细胞过程之一。吸附法的过程技术要求简单，成本低，载体可再生重复利用，空间位阻小，反应过程温和，但是牢固性较差，当外界环境发生突变时，易造成微生物（酶）从载体上脱落。固定化细胞（酶）的结合量以及生物活性收到载体种类的影响较大。在这类系统中，细胞与溶液之间没有屏障，因此不能用于要求出口料液不含游离细胞的场合。
1.3.2 共价结合法
共价结合法是细胞表面上官能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接实现细胞固定化的方法。采用共价结合法固定的微生物与固相载体的结合力较强，但是因为固定过程中反应激烈，操作较复杂，该法条件较难控制，往往容易造成细胞的死亡，对微生物活性存在较大抑制，普遍应用性较差。
1.3.3 交联法
交联法与共价结合法类似，利用载体表面两个或者两个以上官能团与细胞表面的反应基团如氨基、羟基等发生分子间的交联使细胞固定化,使细胞彼此交联，形成网状结构，形成固定化细胞[16]。但交联法所采用的载体是非水溶性的，交联剂多采用戊二醛、甲苯二异氰酸醋、双重氮联苯胺等。交联法固定的细胞与载体联结牢固，稳定性高，但是交联过程生化反应复杂，反应激烈，抑制了微生物的活性，适用范围较狭窄。