包埋法固定化大肠杆菌细胞的研究+文献综述(6)
1.5 本课题研究的意义及思路
腈水解酶是一类能选择性催化腈化合物生成酸和氨的蛋白酶，具有来源广 泛、反应条件温和、高效专一等特点，常用于工农业生产。
用腈水解酶催化的合成反应不仅具有反应条件温和、污染少和易处理等优点,而且更重要的是能实现一般化学法所不能达到的高度化学、区域和立体选择性。其中生物法中的腈水解酶催化法，由于底物价廉、反应条件温和、环境污染小、转化率高、产物光学纯度高，具有良好的工业化前景。而生物法中运用较多的就是包埋法固定化细胞。
固定化细胞的最大优势是稳定性强，可重复利用，Jamuna等利用海藻酸钠（SA）固定枯草芽孢杆菌细胞，结果表明固定化细胞在发酵产酶十次后活性仍然保持不变。在固定化过程中，细胞包埋量、海藻酸钠浓度、凝胶小珠的直径大小对固定化细胞的作用影响较大。M Becerra等利用SA包埋Kluyveromyces Lactis细胞，研究了SA珠体的结构与直径对酶活的影响，发现珠体的直径越小，酶活越高，可能是因为珠体越小，底物与细胞的反应面积越大。王克明以SA为载体包埋固定紫色红曲霉发酵生产红曲色素，发现细胞接入量为20%，SA浓度为4%，CaCl2浓度为4%时，反应结果较佳。而陈九武等采用SA固定产酯酵母细胞，比较不同的SA浓度对形成凝胶小珠的影响，结果表明适宜浓度为1.5% ～30% ，当SA浓度为2.5%时，细胞增殖良好，产酯活性也最高。
海藻酸钠是很好的固定化细胞载体，但海藻酸盐凝胶强度低、易分解破碎，在使用过程中不能抵抗细胞生长所必需的高浓度磷酸盐和Mg2+、K+、Na+等阳离子，因此限制了海藻酸钠载体的应用。为了克服这些缺点，R.E.WILL-IAMS等采用富阳离子高聚物（PEI and PPI.）强化已经成型的固定化细胞珠粒，结果表明强化后的细胞珠粒耐磷酸盐的能力大大提高，尽管处理后的固定化细胞通透性不好，但乙醇的生产并没有减少。Staffan Birnbaum等采用三种方法制备海藻酸钙凝胶固定细胞，方法一：已成型的海藻酸钙固定化细胞珠粒先用聚乙烯亚胺处理再用戊二醛强化；方法二：海藻酸钙凝胶用含硝化甘油和N-羟基琥珀酸亚胺处理（形成酯），和细胞混合后挤压到氯化钙溶液中，形成的珠粒随后用聚乙烯亚胺交联。方法三：海藻酸钙凝胶用高锰酸盐处理（形成醛基），和细胞混合后挤压到氯化钙溶液中，形成的珠粒随后用聚乙烯亚胺交联。这三种方法制备的固定化细胞珠粒在磷酸缓冲液中浸泡十天后形状仍保持完好，且没有细胞释放出来。另外，郑孝贤等采用10%PVA分别加入由海藻酸钠和明胶组成的混合固定剂固定黑曲霉M21，比单一固定剂的效果好，加入海藻酸钠和明胶有助于阻止酶活丧失，其中明胶有保护细胞的作用，是酶活回收率达250%，所以混合型固定剂也是固定化细胞的一个不错的选择。
本实验以海藻酸钠为固定剂，将具有腈水解酶活力的大肠杆菌细胞进行固定化，研究最适的固定化条件，并对固定化细胞的性能进行评价。
2 实验的技术路线和流程
腈水解酶催化腈类转化成相应的羧酸和氨，而且在自然界中分布广泛。除了作为腈具有的效用外(例如，腈除草剂)，这些化合物也为生产各种羧酸提供了方便的底物。腈通过几个化学过程很容易转换成羧酸，但这些过程通常需要强酸或高温条件，而且通常产生的有害副产物或者浪费大量的无机盐。于是我们开始寻求用生物方法将含腈的底物转化为羧酸。
图2.1 利用固定化细胞催化合成腈酸
如图2.1所示，利用腈水解酶可以催化上述反应，将二腈水解成腈酸，得到一种重要的药物中间体。利用生物催化的方法来进行上述反应具有底物价廉、反应条件温和、环境污染小、转化率高等优点，可以解决化学方法中的难题，优化反应条件。本实验采用产腈水解酶的大肠杆菌来做催化剂，催化二腈选择性水解。目前存在的问题是，游离的大肠杆菌只能使用一次，稳定性较差，使用成本较高，满足不了工业化生产的要求，所以本课题研究的目的在于找出固定化大肠杆菌的方法，并且通过各种平行试验和对照试验，优化反应条件，找出最适固定化条件，提高细胞的稳定性，降低使用的成本。