高脂日粮对小鼠子宫发育的影响研究(3)
本研究选取 PARP-1、 PARG、caspase-3 三中相关蛋白作为抗体来探究影响小鼠子宫发育的调控机制。根据有关报道，聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP），即 poly（ADP-ribose）polymerase，是定位在细胞核内，和应激条件下 DNA 修复密切相关的一种酶，是细胞凋亡核心成员半胱天冬酶（caspase）的切割底物。PARP 在体外可以被多种 caspase 剪切，在体内是 caspase-3 的主要剪切对象，因此 PARP也通常被认为是 caspase-3 激活的指标[9.10]。聚（ADP-核糖）的稳态是多细胞生物体中发病机制的重要调节因子，是由合成酶poly（ADP-核糖）聚合酶-1（PARP-1）和降解酶聚（ADP-核糖）糖水解酶（PARG）调节的。PARP 家族的创始成员 PARP-1 在组织损伤，炎症和局部缺血等多种生理过程中起重要作用，但其在卵巢卵泡闭锁与子宫发育过程中的作用尚未完全定义，且 PARG在各种细胞过程中的作用也在很大程度上是未知的[9.11]。据报道，一些 PARP1 结构域可能在导致细胞死亡的各种病理过程中起作用，并且其通过包括 caspase-3 在内的自杀蛋白酶的 PARP1 切割介导[12]。有研究通过免疫组化蛋白定性结果表明，通过激活 caspase-3切割 PARP-1 可能在通过卵巢颗粒细胞变性控制卵巢闭锁中起关键作用， 切割的 PARP-1主要是位于卵巢凋亡颗粒细胞（GCs）中，凋亡颗粒细胞中PARP-1 和 caspase-3 的表达降低[10]，因此我们猜测其在小鼠子宫组织上也有一定的表达，而且在肥胖小鼠与正常小鼠子宫内的表达也可能存在差异。本研究通过长期饲喂雌鼠高脂日粮来诱导小鼠肥胖症，从组织学上观察研究雌鼠子宫与对照组的差异，然后进一步探究高脂日粮对小鼠繁殖性能影响的机理，发现相关的调控蛋白因子，进而研究肥胖对雌性小鼠子宫发育的影响，对动物遗传育种和医学研究具有重要的意义。1 材料与方法1．1 实验动物与器材1．1．1 实验动物 15日龄健康雌性 ICR 小鼠 10 只（购自南京青龙山实验动物研究所）
1．1．2 药品与试剂 葡萄糖、人胰岛素、生理盐水（0.85% NaCl）、4%的多聚甲醛、乙醇、二甲苯、石蜡、柠檬酸钠、甲醇、H2O2、去离子水、磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline， PBS）、苏木精、伊红、DAB、苏木素、BSA、PARP-1、PARG、caspase-3（一抗）、IgG 兔抗(二抗)、SABC（三抗）、中性树胶1．1．3 主要仪器与材料 电子天平、冰箱、电热恒温鼓风干燥箱、DZF-6020 型真空干燥箱、YD-6D 全自动组织包埋仪、L 型金属框、LEICA RM2235组织切片机、HH-S1S电热恒温水浴锅、KEDEE KD-H 烘片机、微波炉、脱色摇床、其林贝尔震荡仪、JBZ-12 型磁力搅拌器、TG16-WS高速离心机、移液枪（枪头）、光学显微镜、虚拟显微镜1．2 试验设计与方法1．2．1 试验动物设计与饲养方案 购买 15 日龄小鼠 10 只，随机平均分为 2 组，每组 5 只，分两笼饲养，湿度和温度（22℃）。一号组小鼠为对照组（C），饲喂普通日粮，二号组为实验组（T），饲喂高脂日粮。每三天称重，记录体重，每周记录摄入日粮重量及饮水的重量，并记录小鼠健康状况，一定时期后检测小鼠超重状况。小鼠肥胖由 Lee’ s 指数确定，Lee’ s 指数=［体重（g）×10^3/体长（cm）］^1/3，其中体长指鼻尖至肛门外沿的距离[13]。
1．2．2 测量组织重量与血清激素检测 饲养到 15 周龄，将小鼠统一称重后颈椎脱位处死，解剖并称取组织重量，包括肝、腹脂、子宫。每只采集眼球静脉全血 4m L，经过离心机离心，收取上层血清于离心管，用化学发光法测定血脂水平等指标。
1．2．3 组织包埋与石蜡切片 于 4%的多聚甲醛中固定 12h 的小鼠子宫和肝脏，在有盖子的瓶内由低浓度到高浓度梯度的酒精中逐步脱水，注意在更换高一级酒精时先用吸水纸吸干以免带入水分；然后在50%酒精和 50%二甲苯混合液中透明 30 分钟，再两次在纯二甲苯中透明 1 小时；接着于 50%二甲苯和 50%石蜡混合液中透蜡 1h，再两次在纯蜡中透蜡 1h；最后将组织在 L 型金属框中用石蜡包埋，用温镊子夹取组织放入框中央，将要切的面朝向框底在石蜡表面，贴上有标号的标签纸，待石蜡全部变硬取出。将组织外的多余蜡块修去，成正方体，必要的是蜡块两侧切成平行面，且不易太靠近蜡块。将蜡块于切片机上调好角度，刻度指针调至 6μm，转动转轮切出一长条薄片，用毛笔拉开， 取子宫和肝脏的直径最大横切面部分挑断， 于 42℃恒温水浴锅中完全展开，用粘附载玻片捞出组织切片，并甩去残余水，在 38℃电热板上烤 24-48h 至切片干燥，收集于切片盒中。
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