指示剂置换法用于生物巯基化合物的检测(2)
指示剂置换法是将一种指示剂首先可逆作用于和它结合的受体，然后引入另一种具有竞争性的目标物，通过受体分子与目标物的相互作用,这种作用要比指示剂和受体发生可逆作用强，从而能将指示剂竞争淘汰下来，且在此方法的过程中常常伴有指示剂在光学信号上的变化，从而可以对目标物进行分析检测[15,16]。现在，许多染料都被用于生物巯基化合物的指示剂置换法：Cheng[17]等将克酮酸染料用于选择性检测Cys、Hcys及GSH；Strongin[18]发现咕吨染料能够用于高效检测Cys及Hcys。这些都表明指示剂置换法在化学分析领域占有不可或缺的地位。
2实验部分
2.1试剂与材料
实验所用试剂如下：磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液（PBS）；紫脲酸铵溶液现配现用；醋酸汞溶液；所有天然性氨基酸和还原性谷胱甘肽，所有溶液均用二次水配制以及所有的玻璃器皿使用前用新鲜王水（HCl:HNO3=3:1,体积/体积）进行清洗。
2.2仪器
UV-1901紫外-可见分光光度仪（中国，北京，普析通用仪器有限责任公司）；pH510台式仪表（美国，Oakton公司）；微量进样枪；石英比色皿。
2.3紫外检测
本实验用UV-1901紫外-可见分光光度仪，在200 nm-700 nm波长范围内对待测溶液的吸光度进行测定。待测溶液的体积为10 mL，温度为室温。
2.4生物巯基化合物的配制
称取0.0121 g Cys、0.0307 g GSH和0.0135 g Hcys至10 mL离心管中，分别加入二次水溶解至10 mL，得浓度均为10 mM的Cys溶液、GSH溶液及Hcys溶液。对上述溶液进行稀释，得到浓度为1 mM的Cys溶液、GSH溶液及Hcys溶液。其中GSH具有还原性，必须现配现用。
2.5选择性实验
配制除生物巯基化合物——半胱氨酸（Cys）、谷胱甘肽（GSH）、同型半胱氨酸（Hcys）以外其余基本氨基酸，使浓度均为10 mM。对上述基本氨基酸溶液进行稀释至浓度为1 mM，再分别加入到待测溶液中，混合均匀后，测量混合液的紫外吸收。
2.6干扰离子实验
本实验选用的干扰离子溶液有Zn(NO3)2▪6H2O、CuCl2▪2H2O、FeCl3▪6H2O、KOH、MnCl2、NiCl2▪6H2O、AgNO3、NaOH、尿素。以上九种溶液浓度均为1 mM，分别加入到待测溶液中，混合均匀后，测量混合液的紫外吸收。
2.7实际样品
取健康成年人的尿液经过每10 mL尿液中加入500 µL NaBH4处理后，作为此次实验的实际样品。实际样品稀释100倍，在pH7.0含有紫脲酸铵和Hg2+的PBS缓冲体系中加入尿样，用于分析检测。将不同浓度的Cys加入含有尿样的体系中，再进行分析检测。所有实验过程均遵守相关法律规定进行。
3实验过程
为了考察Hg2+和紫脲酸铵的相互作用，我们做了以下实验：向含有1 mL 0.2 M PBS缓冲溶液（pH7.0）和250 µL 1 mM紫脲酸铵溶液（紫红色溶液）依次加入到10 mL标准离心管中，逐渐加入1 mM Hg(OAc)2标准溶液，待溶液由紫红色变为浅紫色时停止加样，并用二次水定容至10 mL，用紫外-可见分光光度仪进行检测。
接下来研究了生物巯基化合物对紫脲酸铵-Hg2+溶液的置换作用：向含有1 mL 0.2 M PBS缓冲溶液（pH7.0）、250 µL 1 mM紫脲酸铵溶液（紫红色溶液）和300 µL 1 mM Hg(OAc)2标准溶液依次加入到10 mL离心管中，然后用二次水将溶液定容到8 mL，反应10 min，溶液由紫红色变为浅紫色，逐渐加入1 mM Cys,待溶液由浅紫色再恢复成紫红色时停止加样，并用二次水定容至10 mL，静置10 min，用紫外-可见分光光度仪进行检测。
向含有1 mL 0.2 M PBS缓冲溶液（pH7.0）、250µL 1 mM紫脲酸铵溶液（紫红色溶液）和300 µL 1 mM Hg(OAc)2标准溶液依次加入到10 mL离心管中，然后用二次水将溶液定容到8 mL，反应10 min，溶液由紫红色变为浅紫色，逐渐加入1 mM GSH,待溶液由浅紫色再恢复成紫红色时停止加样，并用二次水定容至10 mL,静置10 min，用紫外-可见分光光度仪进行检测。
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