SHSY5Y细胞分化后DAT的含量变化(2)
2实验试剂
SDS-PAGE凝胶、10％过硫酸铵、SDS-PAGE电泳液、转膜液、DAB混合液、洗涤液、封闭液，二抗、一抗（DAT），转移缓冲液，β-actin，洗脱抗体缓冲液，化学发光试剂，电泳缓冲液，蛋白，蛋白Marker、定影液，显影液。
3实验步骤
3.1前期准备工作
1.无菌洁净室用75％酒精浸泡过的棉球擦拭，移液枪枪头高压灭菌，玻璃板洗净烘干。
2.10%过硫酸铵溶液配制：称取0.1 g过硫酸铵，将其溶解于1 ml蒸馏水中。保存在- 20℃下，同时应减少室温存放时间，以防失效。
3.配制电泳液：Tris粉末15.1 g、Glycine（甘氨酸）94 g、SDS 5.0 g，用蒸馏水定容至1 L。
4.配制转膜液（要冷藏）：Tris粉末3.03 g、Glycine 14.42 g、甲醇150 ml，用蒸馏水定容至1 L。
3.2 SDS-PAGE凝胶配制
凝胶的配制，所用成分如表1所示：
表1.凝胶配制
下层胶 上层胶
10% 胶10 ml 5% 胶3 ml
蒸馏水4.1 ml 蒸馏水1.75 ml
30% Acr-Bis(29:1) 3.3 ml 30% Acr-Bis(29:1) 0.5 ml
下层胶缓冲液 2.5 ml 上层胶缓冲液 0.75 ml
10% 过硫酸铵 0.1 ml 10% 过硫酸铵 0.03 ml
TEMED 0.004 ml TEMED 0.003 ml
3.3 SDS-PAGE凝胶电泳
1.将电泳槽玻璃板用洗涤液洗干净，再用蒸馏水冲洗，接着晾干，备用。制胶时，首先要选择适合凝胶厚度的电泳玻璃板，采取矩形玻璃板在内芯外侧、凹形玻璃板在内芯内侧的方向。
2.选择平整操作台面，将两侧的玻璃全部放入到内芯后，确认矩形玻璃板、凹形玻璃板的底部均与台面平齐，再插入楔形板。用左右两手的拇指均匀用力地下压楔形板的中部，直到压紧，同理安装内芯另一侧的玻璃板。
3.用移液枪将配制好的下层凝胶注入两玻璃板之间，再加入1 ml蒸馏水以观察胶是否凝固。下层凝胶固后，再加入上层胶。
4.插入梳子（注意：梳齿上会出现气泡，应消除）。
5.将安装完毕的凝胶器放置于水平桌面上，等待凝胶聚合。当凝胶聚合后，取下梳子，打开搭钩，从制胶器中取出内芯，放在电泳槽中，此时制胶过程结束。
6.在外槽加入电缓冲液，直至槽体的一半位置时，倾斜槽体，待玻璃板下沿中的气泡全部逸出后再放正槽体，继续加入缓冲液，外槽水位应低于平板玻璃的上沿。在内槽中加注缓冲液，内槽水位应超过凹板玻璃并低于平板玻璃上沿。用微量移液枪在梳井内加样。
7.电泳：盖好上盖，在150 V的电压下电泳1~2 h。待样品指示剂出现在玻璃板的下缘后，关掉电源。