苯并噻唑类ROCK抑制剂的合成工艺研究(3)
有报道称，在测试25种蛋白激酶的抑制试验中，Y227632对其中的21种有不同程度的抑制作用。Y227632除了抑制ROCK外，对蛋白激酶N有同等强度的抑制作用,对MSK1， MAPKAPK1b，citron kinas和PHK)也有较弱的抑制作用(弱10-50倍不等)。在27个激酶抑制实验中，法苏地尔对其中的19个激酶有较强的抑制作用。对 PRK2 / PKN，MSK1，S6K，MAPKA PK1b和PK A，法苏地尔的抑制作用约为前述19个酶的 1/10，而对AMPK( AMP- activated protein kinase )和PHK的抑制作用中等，这表明法苏地尔的选择性比Y27632要低[ 8 ]。H21152对PK A、蛋白激酶C和MLC 激酶 (MLC kinase ) 有选择性的抑制作用( 400到 100倍不等 )， 但对PNK抑制作用尚不清楚。综上所述，本课题的研究意义在于为合成具有高选择性的ROCK抑制剂提供一些指导。
Rho激酶通过直接磷酸化MLC及抑制MLCP活性促进MLC的磷酸化,增强血管平滑肌的收缩,它与依赖Ca2+的激活通路协同作用,在CVS的发病机制中发挥重要作用。盐酸法舒地尔通过抑制Rho激酶，主要扩张中、小动脉（如Willis环等），改善脑血管痉挛引起的脑缺血症状,更有效更安全的治疗CVS。抑制炎性反应，抑制脑卒中迟发性神经元丧失。长期应用Rho激酶抑制剂可预防和治疗高血压性肾小球硬化。Rho/Rho-kinase是胰岛素信号通路的环节，与胰岛素抵抗的形成、胰岛素作用的调节及血糖的稳定有关。因此，ROCK抑制剂可以制成多种药用于日常疾病。
1.2.1 ROCK的结构
ROCK的一级结构。ROCK I与ROCK II属于丝/苏氨酸蛋白激酶。完整的ROCK I与ROCK II大约含有1 300个氨基酸。蛋白质一级结构具有65%同源性,自N 端开始依次包含激酶催化结构域( kinase domain / catalytic domain, CD) 、Rho蛋白结合结构域( Rho2binding domain, RBD ) 、PH 结构域(p leckstrin2homology domain)与半胱氨酸富集结构域( cysteine2rich repeat domain, CRD)。在其中催化结构域同源性比例高达92%。已经发现ROCK在其静息状态下是没有活性的。这是晶体由它的晶体结构决定的，机体ROCK是以一种同源二聚体的形式存在的， PH结构域相互之间的缠绕形成了二聚体。
ROCK的晶体结构。对于ROCK的结合方式目前已有确切分析的一些ROCK抑制剂例如法苏地尔、二甲基法苏地尔与Y227632等主要基于晶体结构研究。 ROCK抑制剂结构当中存在着能够和酶ATP腺嘌呤的结合位点相结合的芳香区药效团。这和嘌呤结构很类似,现在已开发的ROCK抑制剂对于药效团的连接区与饱和环占据着的核糖结合位点也就是磷酸结合位点并没有表现出亲和力。据已经有的抑制剂信息与ROCK空间结构信息， ROCK和ATP结合的精细结构一般可以分A、 F以及D区，这三个区共同形成与ATP结合的口袋结构。口袋的底部是A区，它的结构比较平坦，有比较强的疏水性，在这个区域结合的还ATP的嘌呤基团, ATP嘌呤基的N1会和这个区的Met 167残基的NH之间形成氢键。在A区上方的F区是个平面区域同时它也是疏水的，其和ATP的戊糖环相结合。D区则有5个特异性结合位点。其远端敞口在酶分子的表面。是一个比较自由的区域,，通过在这个区域进行漂移，ATP的焦磷酸尾巴能够将口袋附近的丝氨酸磷酸化。法苏地尔与羟基法苏地尔当中存在的异喹啉环，这些基团较大的芳香团会和Y227632的42氨基吡啶环在口袋的底部相结合；中间连接结构和相对应的ATP戊糖环部位相结合。但是对于在ATP结合外口袋的作用中，这些抑制剂的作用并不大。
ROCK参与的信号通路。目前发现ROCK其主要存在于细胞浆当中，用以调整细胞骨架成分运动；在细胞核也有一些分布，这主要和基因表达调控相关。细胞外存在一些激动剂，例如受体激动剂，在作用于G2蛋白偶联受体之后，会产生两个效应，第一个效应会升高胞浆内钙离子浓度，骨架蛋白将会在肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化后实现收缩。第二Rho蛋白将会在G2蛋白偶联受体活化后变成Rho2GTP。Rho2GTP和ROCK的Rho蛋白相结合。暴露出了ROCK的催化活性中心以此将ROCK激活。这将会导致MLC磷酸化而产生肌丝收缩作用。同时也会把肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)磷酸化，从而能使MLCP失去活性,防止了磷酸化的MLC脱磷酸失去活性。间接的促进MLC磷酸化而促使肌丝收缩。ROCK信号通路的经典途径之一就是参与MLC的磷酸化调控,此外ROCK还参与了其他细胞运动的一些信号通路调节。
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