新型磁性微球的设计及其提取mRNA的研究(2)
3.2.4聚苯乙烯磁性微球的透射电镜图.22
3.3磁性聚合物微球粒径的影响因素23
3.3.1苯乙烯单体用量对粒径的影响23
3.3.2丙烯酸用量对粒径的影响.23
结论25
致谢26
参考文献27
附录30
1 绪论 1.1 mRNA 分离技术简介 近些年来，高质量 mRNA的分离纯化是提高 cDNA文库构建效率的决定性因素，因此如何快速有效地分离 mRNA便成为人们的研究热点和研究方向。mRNA含量较少[1]，在总RNA含量的占比5%甚至更少，给分离提纯的工作加大难度，同时无处不在的RNA酶也会对mRNA造成破坏，使其结构发生变化[2]。目前主要用以下三种方法进行分离提纯 mRNA的工作：过poly（U）琼脂糖柱、寡聚（dT）-纤文素柱层析[3]和寡聚（dT）-磁性微球法[4]，其中后两者应用更为常见。 快速高效地分离 mRNA 基本上是围绕 mRNA 自身特殊的结构特点展开工作[5]，mRNA的结构如图1.1所示。通过观察它的微观结构，会发现成熟的 mRNA结构中都包含一个poly（A）尾巴结构，正因为这个特殊的结构，根据碱基互补配对原则，它的尾巴中所包含的 poly（A）会与 dT 之间形成稳定的氢键结构，从而快速高效的分理出高质量的 mRNA[6]， 这也是分离 mRNA的主要原理。
1.1.1 寡聚（dT）-纤文素柱层析 最先改进本技术即是 1ml 结核菌素注射器填入 oligo（dT）-纤文素[7]。RNA 先是从柱子中流出同时又经过光学检测元件（见图 1.2），检测仪的记录笔分别记下 UV 光吸收和流出液的RNA的浓度。虽然这种方法比我们熟知的其他方法更费时间，但是这种方法的优点就是可以很直接观察到 mRNA的吸收谱的大小[8]。除了峰值大小外，通过观察洗脱图谱的形状，可以判断 mRNA的质量和完整性及纤文素柱层析洗脱效率高低。但是伴随着这些优点，必然又存在缺点，一方面因为洗脱后的溶液体积太大不利于后面实验的 RNA浓缩，另一方面不能检测浓度过低的溶液[9]，因此本技术适于测量总RNA含量高于150µg的样品。
1.1.2寡聚（dT）-磁性微球法分离纯化mRNA 相比于寡聚（dT）-纤文素柱层析法，寡聚（dT）-磁性微球法分离 mRNA的步骤更为简捷，分离方法更为简单[10]，更节省时间[11]，同时利用磁珠分离 mRNA可以有效的避免核糖核酸接触到无处不在的 RNA 酶而变质。这种利用磁性微球分离纯化 mRNA 的不需要传统的亲和柱层析，使核酸分离达到了一个新的高度。这个技术最主要的优势就是磁珠分离 mRNA的速度很快，5min内可完成杂交过程，能够捕获纯的高浓度的 mRNA。还有一个优点即是提纯后的 mRNA可以直接用于后续的实验，包括cDNA文库构建、 RT-PCR扩增、 RNA印迹等[12]。寡聚（dT）-磁性微球法分离mRNA的原理如图1.3所示，在生物分离实验中，最常使用的磁性微球主要是四氧化三铁[13]，主要因为四氧化三铁优异的化学和物理性质[14]，包括生物相容性很好、易于制备、磁响应性优良等。用于分离 mRNA的磁性微球的偶联主要分为两大类，连接特异性序列或者非特异性序列，特异性序列主要是对某类 mRNA的特殊片段进行碱基互补配对，而非特异性序列主要是指偶联dT，前者主要用在分离要求较高的特异性 mRNA，后者主要分离一般的成熟的带有 poly（A）的 mRNA，且分离效果明显优于前者[15]。本课题主要研究的是利用寡聚（dT）-磁性微球分离mRNA。