氧化石墨烯和聚合延伸的荧光发夹引物检测DNA聚合酶(2)
发夹形的寡核苷酸探针广泛应用于DNA-蛋白质相互作用研究[10,12], 诊断遗传病 [11]和检测溶液中的核酸以及活体分析。Tang等人[13]利用双标记的发夹探针，开发了一种实时荧光监测核酸磷酸化过程的方法。单标记的发夹形寡核苷酸与传统的双标DNA发夹探针相比，具有成本低和能提供一个自由端进一步修改的显著优点。
石墨烯是碳材料家族中的最新成员[14]，具有大的比表面积，它只有一个碳原子厚度 [15]。2004年，英国的两位科学家第一次从石墨中分离出石墨烯[16]。石墨烯的基本单元是苯的吹冰元环结构, 这种特殊结构赋予了其独特的热学、力学和电学性能[17]，如优秀的导电性和优良的机械强度，使其成为最理想的材料。GO是石墨烯的衍生物之一，通过产生表面羧酸和羟基来提高其在水中的溶解度。GO具有独特的性质，首先GO能够吸附单链DNA并具有高亲和性，而对双链DNA或DNA片段的亲和力则低得多；其次，GO是一个通用型的荧光猝灭剂，多种荧光体如荧光染料和量子点的荧光可通过GO实现高效率的猝灭。近年来，基于氧化石墨烯（GO）构建的光学生物传感器广泛应用在核酸[18],蛋白质[19]，病毒[20]，金属离子[21]，小分子[22]的检测和药物传输方面[23]。
本论文中，我们设计了一条单标记的荧光DNA探针，它可以自杂交形成发夹引物，并能在目标聚合酶的作用下发生聚合延伸，生成双链DNA聚合产物。GO对双链的吸附能力较弱，因此仍然得到较强的荧光。无目标聚合酶存在时，发夹引物不会发生聚合延伸，由于GO对单链有较强的吸附作用，发夹引物发生荧光淬灭，从而实现对聚合酶活性的灵敏检测。该方法还可以适用于对聚合酶抑制剂的筛选，从而为药物筛选提供了一种简便的方法。
1实验部分
1.1 仪器
荧光光谱仪：JASCO FP-750 日本分光公司； 离心机：型号TDL-4，上海安享科学仪器厂； pH计；超声波清洗仪 型号RQ-500B，恒温水槽。
1.2 药品与试剂
氧化石墨烯固体（通过hummer方法制备，用灭菌水溶解成储备液1 mg/mL）
Klenow Fragment聚合酶(KF, 去除3'-5'外切酶活性)，纽英伦生物技术（北京）有限公司，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)，纽英伦生物技术（北京）有限公司，1× NEBuffer 2 [10 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，10 mM MgCl2，1 mM DTT(pH 7.9 @ 25 ℃)]。
检测液组成为10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2，pH=8.0。
DNA序列（发夹引物HP）由生工生物工程(上海)股份有限公司纯化合成得到。
序列组成：FAM-TAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCGCACCTAAAGGGTGCG。
1.3 实验步骤
实验准备：用1×NEBuffer 2将发夹引物溶解后的储备液取出100L稀释至1M, 放置在沸水中5 min后，立刻转移至冰面上，静置10 min, 以使发夹引物形成稳定的二级结构，最后将上述溶液放置冰箱上层，4度下保存备用。
实验步骤：取0.6 mL的离心管，向里面加入84L反应液（1× NEBuffer 2），6L发夹引物（HP，1M）和5L dNTPs (2 mM)，混合均匀。接着向上述溶液中加入5L不同浓度的KF聚合酶，混合后在37度下反应1 h。后在75度条件下加热10 min，使KF聚合酶热失活。然后加入10L GO（200g/mL）和90L检测液，混合均匀后室温放置10 min。最后在荧光仪上扫荧光发射光谱，保存并记录荧光数据。荧光检测的激发波长为494 nm,收集波长范围为504-600 nm，荧光数据用Sigmaplot进行处理。
2 结果与讨论
2.1 实验原理
图1. 荧光传感器检测聚合酶活性的原理示意图
该实验的原理如图1所示，我们设计了一条荧光标记的DNA链，它的5'末端标记荧光染料，3'末端可以自杂交形成小的发夹结构，可被看作发夹引物(HP)。在KF聚合酶和dNTPs作用下, 从HP的3'末端开始，沿着5'的凸出的单链部分发生聚合延伸，生成双链DNA产物，然后加入GO，由于GO对双链的结合力比较弱，不能发生有效的吸附淬灭, 荧光仍然很强。若无目标聚合酶存在，HP不能发生聚合延伸，发夹5'端仍然是凸出的单链DNA，加入GO吸附猝灭HP，荧光强度显著降低。荧光信号强度跟聚合酶浓度成正比，通过监测传感器荧光信号的变化可实现对目标聚合酶活性的测定。
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