氧化石墨烯和聚合延伸的荧光发夹引物检测DNA聚合酶(3)
2.2 实验原理验证
我们对比分析不同条件下得到的荧光发射光谱图来进行实验原理的可行性进行验证。如图2所示，曲线a代表缓冲液中只有30 nM 发夹引物HP时的荧光光谱响应，当向上述溶液中加入GO后荧光迅速猝灭得到一个较弱的荧光信号（曲线e）。在目标聚合酶和dNTPs同时存在时，发夹引物发生聚合延伸反应生成双链DNA产物，再加入GO，仍然能够得到较强的荧光信号（曲线b）。如果只有dNTPs存在，没有聚
图2. 传感器在不同实验条件下的荧光光谱响应
合酶时，聚合延伸不能发生，加入GO吸附发夹引物进而猝灭其荧光，得到一个类似曲线e的弱荧光信号（曲线d）。如果把聚合酶加热失去活性后再继续和dNTPs混合作用时，同样不能发生聚合延伸，荧光发夹引物被GO吸附猝灭得到一个弱荧光信号（曲线c）。综合以上荧光光谱响应分析可知，该实验设计的原理是可行的，能够用于目标聚合酶活性的分析检测。
2.3 实验条件优化
我们在实验中发现GO浓度、dNTPs浓度和聚合反应时间对荧光信号有较大影响，为达到最佳的检测性能，我们对这些实验条件分别进行了考察优化。我们首先优化的是GO浓度，因为GO直接影响荧光强度的大小。如图3A所示, 不加GO时，发夹引物HP的荧光强度很大，随之GO浓度不断的增大，HP的荧光强度迅速降低。当GO浓度增大至10 g/mL时，荧光强度降低较明显，此时只有较弱的荧光信号，继续增大GO浓度，荧光变化比较微小，说明HP的荧光猝灭接近饱和。如果继续增大GO浓度进行实验的话，有目标存在时的信号强度可能会收到影响，因此我们选用GO浓度为10 g/mL为最佳的浓度，并一直使用在接下来的实验中。
dNTPs是聚合延伸反应的原料，它的浓度也是影响传感器性能的重要参数之一。当其浓度过低时，聚合反应进行不完全，过多时不仅会造成原料的浪费，也会对反应有影响。我们对比分析了不同的dNTPs浓度下的荧光信号比。由图3B可知，随着
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