基于外切酶反应和氧化石墨烯荧光检测碱性磷酸酶的活性(2)
荧光生物传感器的灵敏度高选择性好，在多种生物分子包括蛋白质、生物小分子、核酸等的检测中应用广泛。氧化石墨烯(GO)具有独特的DNA吸附性能和通用型荧光淬灭剂的性质，广泛应用于生物分析领域。
石墨烯是新型的碳纳米材料，具有优异的光学、力学、热学及化学性质，从而在生物分析和功能材料领域有良好的发展前景[13]。氧化石墨烯(GO)是石墨烯的衍生物，具有良好的水溶性和生物相容性。近年来，人们发展了一系列基于GO的光学生物传感器检测核酸[14]、蛋白质[15]、病毒[16]、金属离子[17]和生物小分子[18]。GO具有一些独特的性质拓展了它的应用范围。首先，GO跟单链DNA的结合力较强，而对双链DNA或充分折叠的单链DNA的亲和力低得多。其次，GO是一个通用型的荧光淬灭剂[19]，可以有效猝灭多种荧光染料或荧光体的荧光 [20]。因此，利用GO这两种性质构建的光学传感器具有灵敏度高信噪比大的特点。 另外，GO还具有大的比表面积使其能够有较大的药物负载量，可用于细胞成像。GO对吸附在其表面的核酸有保护作用，可以防止核酸酶的酶切，从而使其在细胞内的生物分析中发挥作用。
Lambda核酸外切酶(λ exo)是具有从DNA末端水解磷酸二酯键生成单核苷酸作用的酶。它主要作用于双链DNA，沿5'-3'方向逐步切去5'单核苷酸。它酶切的最佳底物是5'磷酸化的双链DNA，同时对单链DNA或者非磷酸化的双链DNA底物也有极其缓慢的降解作用。
本论文中，我们借助GO独特的DNA吸附性能和通用型荧光淬灭剂的性质，并利用λ exo对酶切底物的选择性，构建了一种基于GO的荧光生物传感方法检测目标ALP的活性。本实验中的两条单链DNA探针退火杂交成双链DNA，其中一条链末端的5'磷酸化基团可以在ALP作用下去磷酸化，从而阻止了λ exo的酶切，进而保持双链结构不被GO吸附猝灭。荧光强度与ALP的浓度成正比，通过对荧光信号的检测可实现对目标ALP活性的灵敏检测。
1 实验部分
1.1 仪器
荧光光谱仪：JASCO FP-750 日本分光公司；离心机：型号TDL-4，上海安享科学仪器厂；pH计；超声波清洗仪 型号RQ-500B，恒温水槽。
1.2 药品与试剂
氧化石墨烯(GO)固体（通过hummers方法制备，用灭菌水溶解成储备液1 mg/mL）；小牛肠碱性磷酸酶（CIP），纽英伦生物技术（北京）有限公司；Lambda核酸外切酶，纽英伦生物技术（北京）有限公司；
反应液：1×NEBuffer 3 (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2,1 mM DTT (pH 7.9 @25°C) )；检测液：10 mM Tris-HCl， 100 mM NaCl，5 mM MgCl2，pH=8.0
实验所用DNA序列（P1，P2）由生工生物工程(上海)股份有限公司合成纯化，序列组成为：
P1： PO32-GTTATTGATCGAGTGTAGGCCTTAGT
P2：FAM-ACTAAGGCCTACACTCGATCAATAAC
实验准备：首先用灭菌水将两管DNA探针溶解成10M浓度的储备液，混合均匀后，分装数管并各取出一管放置冰箱上层备用。用1×NEBuffer 3 将上述浓度的DNA探针的储备液稀释至1M，并置于冰箱上层保存备用。
1.3 实验步骤
取0.6 mL的离心管，加入6L P1 (1M)，6L P2 (1M)，6L 10×NEBuffer 3和36L灭菌水，混合均匀后放置在95度保持5 min，然后慢慢冷去至室温，以使两条DNA探针能退火杂交形成稳定的双链结构。随后向上述混合液中加入6L不同浓度的目标碱性磷酸酶CIP，并在37度下反应1 h。去磷酸后反应后，继续加入5 L (1U/L λ exo)和35 L灭菌水，继续在37度酶切反应30 min。接着向上述溶液中加入10 L GO (200 g/mL)和90 L检测液，震荡混合后，室温静置10 min，后立刻在荧光仪上进行荧光检测，并及时记录保存数据。荧光检测设置的激发波长为494 nm，发射光谱的收集波长为504-600 nm，实验数据全程用Sigmaplot进行处理作图。
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