诺如病毒中主要衣壳蛋白编码基因的克隆及序列分析(2)
2.2.9 生物信息学分析 16
3结果与分析 17
3.1 诺如病毒衣壳蛋白VP1基因PCR扩增简并引物的设计 17
3.2 诺如病毒衣壳蛋白VP1基因的克隆 19
3.3 诺如病毒衣壳蛋白VP1序列分析 21
3.3.1 测序结果 21
3.3.2 序列分析 21
3.4 pTrcHisB-VP1重组质粒的构建 24
4结论 26
4.1 诺如病毒衣壳蛋白VP1基因的克隆 26
4.2 诺如病毒衣壳蛋白VP1序列分析 26
致谢 28
参考文献 29
附件 31
1前言
1.1 诺如病毒概述
诺如病毒（Norovirus,简称NoV）是杯状病毒科病毒[1,2]，原名为诺瓦克样（Norwalk-like virus, NLV），于2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准更名为诺如病毒[3]，或称诺罗病毒、诺沃克病毒，又称为小圆结构病毒，这种病毒能引起非细菌性急性胃肠炎。临床常表现为起病急骤、恶心、呕吐、腹部绞痛和头疼等不适症状，一般在人口密度较高，卫生环境差的地方容易感染。该病毒由粪便、口水等传播，人食用被污染的蚌类也会感染。
冷冻电子显微镜和计算机图像处理技术研究结果表明[4]，诺如病毒直径27nm，呈二十面体对称，外壳是由180个同一种衣壳蛋白组成的90个二聚体构成[4]。它的血清型有4个，分别是：诺瓦克、夏威夷、雪山、陶顿(Taunton Vires)。NoV的基因组为单股正链RNA，全长约7642bp包括3个开放阅读框(Open Reading Frames，ORFs)。ORFl编码非结构蛋白，包括保守的具有RNA多聚酶在内的蛋白。ORF1编码的顺序从N端开始到C端结束，在蛋白酶作用下裂解成6个非蛋白结构：p48，NTP酶，p22，VPg，蛋白酶，和 RNA聚合酶；ORF2编码分子量约为58×103-60×103的主要衣壳蛋白VPl，其与ORF1的3′端有17-20bp的重叠区域[5,6]，ORF3编码一种分子量约为22.5kda的强碱性小结构蛋白VP2[7]，VPl包含3个区域，N末端区域(N区)、高度保守的壳区(S区)及突出区(P区)。S区由217个氨基酸组成，形成NoV粒子二十面体结构的主框架，组装在核衣壳蛋白的内部；P区位于核衣壳蛋白的外侧，又可细分为适度保守的P1(P1-1和P1-2)和极易发生变异的P2两个亚区，P2区含有与宿主细胞相结合的模序，与病毒的抗原性有关[6,8]。所有已知的诺如病毒从ORFl的C端到ORF2的N端是高度保守的[9]。
目前，是用RT-PCR扩增ORFl的RNA多聚酶的末端来诊断大部分GII型的诺如病毒，同样这种方法也可用于分子流行病学的研究，ORFI比ORF2相对保守。根据诺如病毒RNA多聚酶区和衣壳区的核苷酸序列，将NoV分为5个基因组：GI，GII，GIII，GIV，GV。最新研究表明，根据ORF2全基因序列，NoV GI可分为14个基因型，NoV GII可分为17个基因型。感染人的NoV包括GI、GII和GIV，而基因组GIII和GV分别感染牛和鼠。我国主要的感染株是GII.1、GII.3和GII.4型，GII.2型在我国尚未发现。其中GII.4又分为GII-4A、GII-4B、GII-4C、GII-4D、GII-4E。VPl区基因编码的氨基酸同源性应大于80％，或者GI，GII RNA多聚酶区基因编码的氨基酸同源性分别大于85％和90％则属于同一个基因型。诺如病毒极易发生变异，在同一时期和同社区内可能存在遗传特性不同的毒株流行。引起婴幼儿急性胃肠炎的NoV易出现基因变异株。引起日本2006年胃肠炎大流行的优势株NoV GII.4基因型可能部分基因发生了突变。自1997年首次发现雪山病毒自然重组株后，又发现了几株引起急性胃肠炎散发的暴发的重组株。病毒RNA的重组是病毒进化的主要驱动力之一。近年来该病出现较大范围的流行是否与病毒基因的变异有关，目前正在进行研究中[10]。