土壤微生物来源的β-内酰胺酶的异源表达与功能分析(2)
β-内酰胺类抗生素是一类含有典型β-内酰胺环结构的抗生素，主要包括头孢菌素类、青霉素类、青霉烯类及单环β-内酰胺类抗生素[7]。其抗菌机理为干扰细菌细胞壁黏肽的合成，使得细菌细胞壁缺损，菌体失去渗透保护屏障后而发生菌体肿胀、变形，最终在自溶酶的激活作用下，细菌发生破裂溶解而死亡。由于β-内酰胺类抗生素抗菌谱广、对人类及动物安全、效果好、构效关系明确、可改造、工业水平高等优点，所以被大量开发应用。在今后相当一段时间内，仍是抗生素生产应用发展的主流[8]。该抗生素耐药机制主要包括：细菌产生的β-内酰胺酶对抗生素的破坏导致耐药；细胞壁的屏障功能导致耐药；细菌内膜上PBPs的改变导致β-内酰胺类抗生素不再能专一性地与其结合，而导致细菌产生耐药性等。其中，β-内酰胺酶是目前研究最为深入的耐药机制之一。
随着宏基因组学的深入研究与发展，研究人员已在多种来源的宏基因组文库中发现了新型β-内酰胺酶[9]。从遥远的阿拉斯加地区采集的土壤样品苏构建的宏基因组文库中，研究人员通过功能筛选的方法获得了13种新型β-内酰胺酶，这13种新型β-内酰胺酶包含了所有的四种Ambler类型，且经过比对，其与任何已知的功能基因的相似度都≤67％。此外，在该宏基因组文库中还发现了一个新型双功能β-内酰胺酶基因。该基因编码了609个氨基酸，是典型β-内酰胺酶长度的近两倍，且是两种不同的β-内酰胺酶亚类基因的天然融合物。C端结构域（356个残基）与C类β-内酰胺酶对齐，N端结构域（253个残基）却与D类β-内酰胺酶对齐，每个都对全基因的抗性谱有贡献。C类同系物介导了头孢氨苄的抗性，D类同系物则介导对阿莫西林、氨苄青霉素以及羧苄青霉素的抗性。因此，双功能融合基因扩展了全长基因的抗性谱，超出了任一结构域单独作用的作用[10]。
目前，利用功能筛选方法发现的β-内酰胺类抗生素耐药基因至少有66种[11]。如2012年，Cheng. G等人[9]在人肠道微生物组中分离得到了一种新型β-内酰胺抗性基因；2014年，Fiona. F等人[12]在婴儿肠道微生物文库中筛选得到了β-内酰胺抗性基因。
宏基因组学技术以及遗传学、分子生物学的发展，为最大限度的挖掘土壤耐药基因组提供了无限可能。除此之外，我国所具有的丰富的土壤环境和极具特色的土壤生态系统中蕴含着大量的微生物类群，但是由于我国宏基因组学起步晚，利用宏基因组学技术挖掘土壤中耐药基因组的研究尚属空白，亟待我们去探索发现。
本课题以珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库中筛选得到的两个头孢菌素类耐药阳性克隆为研究对象，构建亚克隆，经生物信息学分析插入片段序列，并对其携带的功能基因β-内酰胺酶基因进行异源表达，并对表达产物进行蛋白功能分析。
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