烤鸭中水溶性提取物的体外抗氧化活性研究(8)
旋转蒸发器
台式离心机 RE-52AA
TDL-5 上海亚荣生化仪器
上海安亭科学仪器厂
电子天平 AL204 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司
冰箱 KK26E28TI 西门子（中国）有限公司
pH计 Delta320 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司
提取罐 / 天津市德固科技发展有限公司
2.2美拉德反应产物的提取制备
（1）将切碎的全聚德烤鸭的鸭肉2kg进行真空干燥，得到1200g样品。然后将样品水煮2次（每次2小时，煮制过程中要防止暴沸），用纱布把样品过滤，旋转蒸发至粘稠状，即粗提物。将粗提物放于4°C冰箱保存备用。
（2）称取10g样品，加入2L蒸馏水，超滤：将所得到的水溶性粗提物倒入超滤机中进行分离提纯，透过5000Da的超滤膜进行超滤分离，收集超滤所得的质量分数在5000以下的二次提取物并用旋转蒸发仪进行旋转蒸发，冷藏待用。
（3）凝胶柱层析：将超滤并旋转蒸发后的滤液按10%的浓度加入到凝胶层析柱中进行层析分离，最终分别得到了四个峰值处的的三次提取物，放置于4°C冰箱中保存，防止其变质。
2.3抗氧化活性研究方法
2.3.1清除DPPH自由基法[21]测定粗提物的抗氧化活性
DPPH•配制：
称取0.0394gDPPH溶解于100ml容量瓶，定容，摇匀，作为储备液（1.0×10-3mol/ L）避光保存于冰箱，用时逐级稀释（用乙醇溶解）。
测定：
将烤鸭样品用蒸馏水分别稀释成0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%）五种浓度的溶液。
(1)取待测样品2 mL及浓度为l.0×10-4mol/ L DPPH溶液2ml先后加入同一具塞试管中，摇匀，在黑暗中室温放置30 min，以乙醇为参比，在517nm测定其吸光度Ai。
(2)取2ml的乙醇与浓度为1.0×10-4mol/ L的 DPPH溶液2ml混合，摇匀，在黑暗中室温放置30 min，以乙醇为参比，在517nm测定其吸光度Ao。
(3)取2ml待测样品与2ml无水乙醇混合，摇匀，在黑暗中室温放置30 min，以乙醇为参比，在517nm测定其吸光度Aj。
每组做三次平行实验，取平均值。
根据下列公式计算提取液对DPPH的抑制率，即：
抑制率（%） =（1-(Ai-Aj)/Ao）×100%（1）
式中：Ai为加抗氧化剂后DPPH溶液的吸光度；A0为末加抗氧化剂时DPPH溶液的吸光度；Aj为待测样品在测定波长的吸光度。Aj是为了消除浸提液本身颜色对测定的干扰。抑制率越大，抗氧化活性越高。
2.3.2 ABTS法测[22]测定粗提物的抗氧化活性
ABTS自由基的制备：
（1）7mmol/L ABTS的配制：称取0.0960g ABTS，用蒸馏水定容到25ml。
（2）140mmol/L K2S2O8 (过硫酸钾)的配制：称取0.3784g K2S2O8,用蒸馏水定容到10ml。
（3）ABTS储备液的配制：5ml 7mmol/L ABTS 加88μl 140mmol/L K2S2O8，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS储备液。使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求在734nm波长下吸光度值为0.7±0.02。
测定：
将烤鸭样品用蒸馏水分别稀释成0.25%、0.5%、1%、2%、4%五种浓度的溶液。
准确量取9.8ml的ABTS•+工作液于试管中，加入200ul的样品溶液，摇匀后静置5min,以蒸馏水为参比，在734nm波长下测其吸光度Ai；同时测定9.8mlABTS•+工作液与200ul无水乙醇混合液的吸光度Ao，9.8ml的无水乙醇与200ul的样品溶液的混合液的吸光度Aj。
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