分光光度法测定腈水解酶活性的研究(2)
2.1.4 朗伯－比尔定律 8
2.1.5 高通量筛选 8
2.2 实验方案的确定 9
3 试验方法与材料 10
3.1 实验材料 10
3.1.1 菌种 10
3.1.2 培养基 10
3.1.3 发酵液 10
3.1.4 主要仪器 10
3.1.5 主要试剂 11
3.2 实验方法 11
3.2.1 苯酚－次氯酸钠比色法 11
3.2.2 分光光度法 12
3.2.3 分光光度法各个条件的优化及标准溶液曲线 12
3.2.4 高效液相色谱法 15
3.2.5 菌体培养 15
3.2.6 测活过程 15
3.2.7 加标回收率 16
3.2.8 精密度 16
4 实验结果和讨论 18
4.1 水浴时间对反应的影响 18
4.2 水浴温度对反应的影响 19
4.3 显色试剂对反应的影响 20
4.3.1 A液对反应的影响 20
4.3.2 B液对反应的影响 21
4.4 标准曲线 22
4.5 比色法与HPLC比较 23
4.5 加标回收率 23
4.5 精密度 24
5 总结与展望 25
致谢 26
参考文献 27
1 研究背景1.1 生物催化
生物催化法是利用生物酶作为催化剂，立体选择性控制合成化合物的方法，与经典的化学合成方法相比，具有以下几个优点。一，反应条件温和。无需强酸或强碱、极端温度和压力；二，立体选择性好。可避免因反应条件苛刻而导致的消旋化、异构化及重排等副反应，也免除了传统有机合成中通常为了阻断不必要的副反应而需要的基团保护和去保护措施；三，反应高效。酶是一种高效催化剂，能大幅度加快反应速度，最高可达非酶催化反应速度的106 ～1013倍；四，毒副作用小，环境污染少。酶催化反应因为其一般不会产生毒副产物，在环境污染问题上比传统化学合成方法要小得多，所以被称为绿色合成化学。
生物技术其实质是依靠生物催化剂从事生物技术产品的生产来为社会服务。目前，生物技术也成为在现代医药方面应用最关注的领域之一，为了争夺生物制药工业的市场，各国正在大力发展以知名大学和研究机构为中心，带动企业而形成的产业群[1] 。目前，工业所用酶大部分来自微生物，少数来自植物和动物也可通过基因工程和蛋白质工程等现代生物技术大规模生产，具有广阔的应用前景和商业价值。正如DSM公司Wubbolts博士在Science上发表文章预测的那样：“生物催化正蓄势待发，在对映体拆分和不对称合成等领域中将获得更加广泛的工业应用”[2,3] 。
1.２ 腈化合物及腈水解酶
腈化合物是一类含氰基官能团的化学物质(R-CN)，可以看作是氢氰酸分子(HCN)中的氢原子被烃基取代后的生成物。腈化合物种类繁多，目前，人工合成的和自然界存在的腈类化合物，总数目已经超过20000种，而其中大部分来自人工合成。天然腈存在于植物、真菌、细菌、藻类、海绵、昆虫、甚至哺乳动物中[4]。由腈化合物出发可以获得酰胺、酸、酯等价值更高、应用范围更广的一类化合物，它们别广泛地应用于合成化工原料、医药中间体以及文生素的前体。腈化合物的化学水解因为需要强酸(或强碱)、高温、高压等苛刻的反应条件，而且常伴随有大量盐类形成，给分离纯化带来困难，也造成一定污染，因此在很大程度上限制了其在工业上的应用。