分光光度法测定腈水解酶活性的研究(3)
经研究表明腈水解酶催化腈化合物的水解具有高效性、专一性、反应条件温和、污染小等优点，符合原子经济性和绿色化学的发展方向。其优良的化学、区域及立体选择性更是化学方法无可比拟的[5-7] 。
1.３ 腈水解酶的选择性
1.３.1 腈水解酶的立体选择性
近几年来，对手性物质的要求越来越严格，腈水解酶催化反应的立体选择性也逐渐成为关注的热点。外消旋腈化合物在腈水解酶的催化作用下不但能转化成光学活性的羧酸，而且还能获得较高的对映体过量值(e.e.值)。这种直接得到高纯度的光学活性羧酸的方法，降低了能耗，因此极具发展潜力。
在1991年，Yamamoto等人首次报道了以Alcaligenes faecalis ATCC 8750为催化剂。催化外消旋扁桃腈，得到R型扁桃酸，对映体过量值e.e.达到100%，于扁桃腈和苯甲醛、氰氖酸之问的可逆反应，使得S型扁桃腈外消旋化，从而使得转化率也达到90%以上。此方法已经成功地应用于工业化生产R型扁桃酸[8]。Kaul等人将从AIcaligenes faecalis DSMZ 30033中得到的立体选择性腈水解酶进行交联聚合研究 [9] 。Banerjee等人 [10] 则利用水解产物羧酸会释放氢离子，使得反应体系的pH值下降这一特性，选择合适的指示剂。以Alcaligenes faecalis MTCC 126为阳性对照，通过观察指示剂颜色的变化来判断扁桃腈水解反应的发生，从而建立了相对快速的筛选方法(见图1.1)，再挑选具有腈水解酶活力的菌株进一步确定其选择性。通过该方法，成功地筛选到了Pseudomonas putida Microbacterium paraoxydans，Microbacterium liquefacien等几个菌株。这几个菌株都能水解外消旋扁桃腈。得到产物R型扁桃酸，e.e.值达到99%，但是转化率不高。
图1.1 指示剂颜色的变化
Layh等人也做了很多有关芳基乙腈类腈水解酶立体选择性方面的研究 [11-12] 。首次报道了除Alcaligenes faecalis以外的产芳基乙腈类腈水解酶的微生物[13] 。对Pseudomonas fluorescens DSM7115中存在的具有立体选择性的腈水解酶进行了研究。研究发现，在苯乙腈作为氮源培养时，该微生物表现出腈水解酶的活性，其中，苯乙腈起到了诱导作用。底物特异性实验表明该酶属于芳基乙腈类的腈水解酶。
相对于立体选择性芳基乙腈类腈水解酶，尽管脂肪族腈水解酶相对较少，但脂肪酶的菌株已见报道，如假单胞菌[14] 、链霉菌[15] 、丝胞酵母[16] 、假丝酵母[17] 、黑曲霉[18] 、根霉[19] 、类产碱假单胞菌[20] 等，不断筛选具有新特性的高活力的脂肪酶生产菌株能够扩展脂肪酶的应用研究[21] 。Gradley等人发现Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216催化α位取代的己腈的水解反应具有立体选择性[22] 。立体选择性的脂肪族腈水解酶可应用于γ-丁内酯的制备[23] 。
1.3.2 腈水解酶的区域选择性
很多腈水解酶能选择性地催化二腈中一个氰基水解。将其转化成用其它方法尚难合成的单氰基羧酸。而关于酶催化下三腈的区域选择性水解的研究则相对较少。学者以Rhodococcus rhodochrous LL100—21为催化剂，考察了其对几种二腈的区域选择性水解[24]，认为其选择性在很大程度上取决于两个氰基的所处的相对位置。与苯环相连的氰基位于间位和对位时。得到的产物为氰甲基苯甲酸，即水解了与苯环相连的氰基。只有当该氰基位于邻位时，才会水解脂肪侧链的氰基。可能的原因是位于邻位的脂肪侧链对与苯环相连的氰基的水解反应造成了极大的位阻效应，如图1.2所示。
图1.2 脂肪侧链对与苯环相连的氰基的水解反应造成的位阻效应