猪链球菌菌蜕疫苗的制备研究(2)
1 材料与方法1.1 试剂及仪器THB(Todd-Hewitt broth )为美国 BD公司产品，氢氧化钠（NaOH）、戊二醛、吐温-20 和浓硫酸（H2SO4）购自南京卓越生物公司；酶标羊抗小鼠二抗购自诺唯赞公司；TMB 、细菌基因组 DNA 提取试剂盒（离心柱型）为 TIANGEN 公司产品，BSA、琼脂粉为 DSBIO 公司产品，氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、磷酸氢二钾（KH2PO4）、碳酸氢钠（NaHCO3）、无水碳酸钠（Na2CO3）购自广东西陇化工股份有限公司。PCR仪购自德国耶拿分析仪器股份公司，DYY-6C 型电泳仪购自北京吹冰一仪器厂，凝胶电泳成像系统（BIO-RAD）JS-Power 600电泳仪购自上海培清科技有限公司，紫外可见分光光度计、离心机购自 Thermo，超声波细胞破碎仪 XO-900D 购自南京先欧仪器制造有限公司，水浴锅购自北京东方精瑞科技发展有限公司，分光光度计购自Eppendorf。1.2 菌株与实验动物猪链球菌 2 型强毒株 ZY0517，9 型 WH1609， 南京农业大学 OIE 猪链球菌病参考实验室保存。 SS2和SS9菌株用THB液体培养基和THB平板放于37℃CO2培养箱培养。BALB/c 实验小鼠购自扬州大学动物实验中心。
1.3 方法1.3.1 SS2 和 SS9 的生长曲线 在 THB 固体培养基上划线复苏 SS2 和 SS9，置于37℃CO2培养箱培养 24h。 挑单菌落于 THB 液体培养基， 置于 37℃CO2培养箱培养过夜。取 37℃恒温复苏的猪链球菌， 按 2%的比例接种到 50ml THB 液体培养基中， 于 37℃ 220rpm 恒温培养箱中培养，分别在 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、48h 后取菌液 1ml，5000r/min离心 5min，弃去上清液，加磷酸盐缓冲液（1L PBS：1.42g Na2HPO4，0.27g KH2PO4，0.2g KCl，8g NaCl，pH 7.4）重悬后，以 PBS 为空白对照测定其 OD600值，每个时间点重复测定 3 次，取其平均值。
1.3.2 MIC 的判定 在 THB 固体培养基上分别划线复苏 SS2 和 SS9，置于 37℃CO2培养箱培养24h。 挑单菌落于THB液体培养基， 置于37℃CO2培养箱培养4h （此时OD600nm值在 0.6-0.8）。离心（5000rpm，5min）收集菌体并用 PBS 洗三遍。最后一次洗用 PBS重悬。最后一次洗完收集的菌体用 PBS 重悬并将菌液浓度调整为 1×109CFU/mL。配置NaOH 溶液并将其浓度调整为 150、125、100、75、60 以及 37.5mg/mL。在6个1.5ml Ep管内依次加入不同浓度 NaOH 溶液 100μL，然后各管均加入900μL 菌液，使 NaOH溶液的最终浓度为 15、12.5、10、7.5、6 以及 3.75mg/mL。每一个 NaOH 浓度做三个重复。置于37℃CO2培养箱培养24h。 每管取10μL培养物涂布到THB平板上于37℃培养36h，观察有无菌落生长。1.3.3 SS2 菌蜕和 SS9 菌蜕的制备 分别挑 SS2 和 SS9 单菌落于 THB 液体培养基，置于 37℃CO2培养箱培养 4h。离心（5000rpm，5min）收集菌体并用 PBS 洗三遍。最后一次洗完收集的菌体用 PBS 重悬并将菌液浓度调整为 1×109CFU/mL，NaOH 溶液的浓度调整为 60mg/mL。1mLMIC 的 NaOH 溶液（对照组为 PBS）加入到 9mL 细菌悬浮液中，混匀，置于 37℃CO2培养箱培养 24h。取出 100μL 混合物涂布 THB 平板，置于37℃温箱培养 36h，计菌落数。剩余混合物通过离心（5000rpm,5min）收集，弃去上清，4℃保存菌体沉淀备用。1.3.4 SS2 菌蜕和 SS9 菌蜕生长观察 将制备好的SS2 菌蜕、SS9菌蜕和未经处理的菌体分别用 PBS 重悬制成菌悬液，分别接种于 THB 固体培养基，置于37℃CO2培养箱培养 24h，观测菌落的生长情况。1.3.5 SS2 菌蜕和 SS9 菌蜕琼脂凝胶电泳检测 SS2 菌蜕、SS9 菌蜕和未经处理的菌体分别用 PBS 重悬制成菌悬液，提取菌体 DNA，对提取的 DNA进行电泳。每个样本，做三个重复。1.3.6 SS2 菌蜕和 SS9 菌蜕表面结构的观察 SS2 菌蜕、SS9 菌蜕和未经处理的菌体分别用 PBS 重悬制成菌悬液，加入 2.5%戊二醛固定，送到上海釜诚生物科技有限公司进行扫描电镜观察。1.3.7 动物实验1.3.7.1 实验动物的分组与免疫 为评估菌蜕疫苗的免疫原性和对 BALB/c 小鼠的免疫保护效果，将 60 只 4 周龄 BALB/c 小鼠随机分 5 组，除 A 组为 20 只，其余每组 10只。A 组，背部皮下注射无菌 PBS 0.1mL/小鼠；B 组，背部皮下注射SS2灭活苗（终浓度 0.4%甲醛灭活的，用PBS 将菌液浓度调整为 1×109CFU/mL，用弗氏佐剂 1:1 乳化）0.2mL/小鼠；C 组，背部皮下注射 SS9 灭活苗；D组，背部皮下注射 SS2 菌蜕疫苗（菌液浓度调整为 1×109CFU/mL）0.1mL/小鼠；E 组，背部皮下注射 SS9 菌蜕疫苗。每两周加强免疫一次，共免疫 2 次。
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