猪链球菌菌蜕疫苗的制备研究(3)
1.3.7.2 实验动物血清的获得 在首次免疫后，第 7 天，第 14 天，第 21 天和第 28天，用小鼠眼眶静脉采血法，对每组小鼠进行抽样采集血样，每次每组各随机采 5 只。将所得血样静置于 37℃温箱 1h 后，再置于 4℃过夜，离心（3000rpm,10min）取上清即血清，-20℃冻存，用于检测抗体水平。1.3.7.3 血清效价的检测 通过间接酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清中的抗体水平。 分别挑 SS2单菌落和SS9 单菌落于 THB 液体培养基， 置于37℃CO2培养箱培养，过夜。 离心 （12000rpm,2min） 收集菌体， 用 PBS 重悬后超声破碎。 离心 （9000rpm,10min）弃沉淀，留存上清。用包被液（Na2CO3 0.75g，KCl 0.1g，NaHCO3 1.45g，加水至 500ml）稀释上清，将蛋白浓度调整为 10μg/mL。抗原包被，在酶标板的每孔内加入100μL 蛋白浓度为 10μg/mL 的上清，置于 4℃包被过夜。弃掉孔内的液体，拍净，用 PBST（PBS加 0.5‰吐温-20）洗 3 遍。封闭，加封闭液（100ml PBST 加入 0.5g BSA）330μL/孔，37℃作用 2h。甩掉孔内的液体，拍净，用 PBST 洗 3 遍，4℃保存。用封闭液稀释血清，1:50、1:100、1:200 稀释。稀释好的血清 100μL/孔加入到包被好的板子上，A、B、D 组血清加入到用 SS2 蛋白包被的板子，A、C、E 组血清加入到用 SS2 蛋白包被的板子，37℃作用 2h。弃掉孔内的液体，拍净，用 PBST 洗 3 遍。用封闭液 1：10000 稀释二抗，每孔加 100μl， 37℃作用 1h。 弃掉孔内的液体， 拍净， 用 PBST 洗 3遍。 加显色液（TMB）100μL/孔，室温避光显色 15min。加终止液（2M 硫酸）50μL/孔终止显色，10min 内用酶标仪测OD450值。 此外， 每块板子至少设置1孔阳性和1孔阴性对照， 阳性对照的OD450值/阴性对照 OD450值>2.1 则所测血清效价可信。
1.3.7.4 攻击保护试验 第 2 次免疫后两周对所有小鼠进行攻毒。 在THB 固体培养基上划线复苏 SS2 和 SS9，置于 37℃CO2温箱培养 24h。挑单菌落于 THB 液体培养基，摇床培养 180r/min，37℃，8h。取 200μL 培养 8h 的菌液加入到 5mL THB 液体培养基，置于 37℃CO2温箱培养 4h。离心（5000rpm,5min）收集菌液，PBS 洗 2 遍。调整猪链球菌液浓度为半数致死量浓度， SS2菌液浓度为5×108CFU/mL， 调整SS9菌液浓度5×103CFU/mL，为每只小鼠腹部皮下注射 0.2mL 菌液，每天观察 2 次，持续 1 周，记录各组发病和死亡情况。
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