植物内生真菌的分离纯化及其代谢产物的抗肿瘤活性检测(2)
在人们的印象中，真菌会引起真菌感染，但是存在于生长状态良好的植物体内的内生真菌，其实不会对寄主植物组织产生感染 [2]。此外，真菌往往容易培养，培养过程易控制，通过现代生物技术使遗传性状容易转变等特点。近几年来，随着人们不断拓宽研究领域，深入研究方法，作为活性天然产物的重要来源，植物内生真菌已经成为一个新的生物资源，越来越多受到关注。
植物内生真菌的代谢产物非常丰富，1993 年 Stierie 等[3]从短叶红豆杉的韧皮部分成功地分离出一种内生真菌，它与宿主产生同样的代谢产物紫杉醇，具有抗肿瘤的活性。此后在国内外，类似的研究成果络绎不绝地出现[4,5]。为提高所需化合物的含量，利用真菌在自然界大量存在的有利性，我们既可以发酵生产，也可以改良、控制发酵工艺，进行菌种选育，手段繁多，开发抗肿瘤药物将成为一项非常具有发展前景的产业 [6]。
从现有的研究成果中，我们可以了解到，人们从抗肿瘤珍稀药用植物如南方红豆杉、三尖杉和香枢等中，已成功地研究出具有很高药用价值的新型化合物, 我国的珍稀药用植物内生真菌的研究和开发工作，正不断取得突破，硕果累累：紫杉醇开发成抗肿瘤新药，三尖杉中分离出三尖杉醋碱，高三尖杉碱已成为白血病的良药备受关注。这些研究在解密植物与内生真菌的关联、开发植物内生真菌的药用资源以及濒危药用植物的生态保护等方面，在理论和实用上都有巨大的意义[7]。
现在，关于植物内生真菌已经有过大量的先行研究，但是其取样多来自药用植物。本课题从日常生活的普通植物（例：桂花，冬青，花生，红薯等）中取样，先用组织分离法分离出内生真菌，再用MTT法检测代谢产物的活性检测。获得1株抗肿瘤活性较高的菌株，并对其分类地位进行了鉴定。
1材料与方法
1.1植物样品的采集
本研究在2014年10月到11月间分别于南通和安徽地区采集植物标本，采集时，一般选择生长性状良好、无枯枝烂叶、无病虫害症状的的健康植株。采回来后，应尽早进行分离实验。
1.2培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA)，详见刘树蓬《内生真菌的多样性及其活性物质的检测》[8]。
1.3实验仪器
手提式蒸汽灭菌锅；荧光倒置式生物显微镜；凝胶成像系统；MP21001电子天平；电子分析天平；PCR扩增仪;SpectraMax M2多功能酶标仪；Microcl 17R 高速离心机；超净工作台；量筒；烧杯；容量瓶；锥形瓶；塑料锥形瓶；移液管；恒温培养箱;恒温水浴锅；制冰机；电磁炉；搪瓷缸；微波炉；20μL、200μL和1000μL型号的移液枪；接种针；酒精灯；铝箔纸；环氧乙烷灭菌的塑料培养皿；玻璃培养皿；96孔板；摇床；2mL离心管；玻璃棒；冰箱；冻存管；铁锅；75%酒精棉球；电泳仪；剪刀；接种针;镊子；解剖刀；接种环;1.8mL冷冻管,培养皿；计时器；标签纸；记号笔；粉碎机等。
1.4植物内生真菌的分离和纯化
采用组织块分离法[9]，对35 种植物中内生真菌进行分离。
1.4.1 试剂
70%酒精,无菌液体石蜡，3%次氯酸钠（本实验用4%84）。
1.4.2取样
用蒸馏水将植物表面清洗干净，在叶片的左上、右上、左下，右下和正中五个部位进行取样，剪取5mm*5mm的叶片，如果是叶柄或枝干，则剪取5~10mm，若是比较粗的枝干或圆圆的果实之类的，则将它切开，再剪取样本。
1.4.3表面灭菌
在无菌操作台中进行，先向试管内倒入适量的70%乙醇。拧紧盖子，用计时器开始计时1min，每隔10s上下晃动试管几次。1min后，拧松盖子，将乙醇倒入事先准备的锥形瓶，然后，再向试管倒入40ml 4% 84，拧紧盖子，用计时器开始计时10 min，每隔1min上下晃动试管几次，10 min后，拧松盖子，将4% 84倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管中样本倒出，若倒出不要再放回其中，也不要用手碰到样本，样本不可以接触到除了离心管以外的东西。最后，用无菌水冲洗三遍，操作步骤同上。清洗完后，将标本放在离心管的盖子中。
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