模拟人体消化评价乳酸菌发酵豆乳蛋白消化情况(3)
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 原料
原料为食品院微生物实验室购买无霉变、无虫蛀的干燥黄豆。
1．1．2 菌种
实验室保藏植物乳杆菌B1-6。
1．1．3 培养基
MRS培养基（食品院微生物实验室提供）：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，无水乙酸钠5 g/L，柠檬酸胺2g/L，磷酸氢二钾2.62 g/L，硫酸镁0.58 g/L，硫酸锰0.198 g/L，吐温80 1 ml/L，琼脂1.5% ~ 2%。121℃高温灭菌20 min。
1．1．4 仪器设备
表1 仪器设备
名称型号 生产厂家
MP2002电子天平 南京远拓科学仪器有限公司
AUY120电子精密天平 日本岛津电子天平厂
豆浆机 山东九阳股份有限公司
手提式压力蒸汽灭菌锅 上海华线医用核子仪器有限公司
超净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司
EasyfermPlus ARC 120生物制药pH电极 天津恩耐德科技有限公司
PB-10pH仪 德国SARTORIUS有限公司
LRH系列生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司
SHZ-28A水浴恒温振荡器 太仓市华美生化仪器厂
A-vanti J-E冷冻离心机 美国Beckman Coulter有限公司
722 可见分光光度计 上海精密仪器仪表有限公司
GZX-9140 MBE数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司
STG全塑通风吸毒柜 南京住宅建设总公司环保防腐通风设备厂
DYY-2C型电泳仪 北京市吹冰一仪器厂
TY-80R脱色摇床 金坛市仪都仪器有限公司
Tanon 1600凝胶成像系统 上海勤翔科学仪器有限公司
1．2 实验方法
1．2．1 菌种活化
取保存在甘油管中的植物乳杆菌B1-6接种于30 mL MRS培养基中，37℃活化24 h，取2 mL活化后菌液，接种于50 mL MRS培养基中（接种量为4%），37℃活化14 h，放入4℃冰箱备用。操作中在超净工作台，注意紫外灭菌和无菌操作。
1．2．2 发酵豆乳
挑选无霉变、无虫蛀的干燥黄豆，浸泡过夜，按豆水比1：9进行磨浆，过滤后分装在150 mL锥形瓶中（各80 mL豆乳），灭菌后冷却放入4℃冰箱备用。
取分装好的无菌豆乳于37℃复温，取活化好的菌液洗菌接种2.4 mL于80 mL豆乳中，接种量为3%，放入37℃恒温培养箱，使用在线监测pH计监测发酵豆乳的pH值，分别发酵至pH6.0、pH5.7、pH5.4、pH5.1时取出，进行下一步实验。
1．2．3 体外模拟消化
本实验体外模拟消化是采用多酶法，利用连续消化模型模拟食物在体内的消化情况，模拟了豆乳在人体口腔、胃和小肠消化过程。按照人体内的消化顺序以2.5（样品）：1.0（唾液）：1.5（胃液）：1.0（胰液）：1.0（胆汁）的比例向豆乳样品中添加消化液模拟人体生理状况。消化过程中采用4 M HCL和4 M NaOH调节豆乳样品的pH值。
将豆乳样品取出后用匀浆器研磨，体外模拟消化前取样P0(5 mL)；
将豆乳样品研磨后取出60 mL加入24 mL α-淀粉酶溶液（0.2 mg/mL 20 mM磷酸盐缓冲液）,置于37℃ 55 rpm振荡3 min,模拟口腔消化后取样P1-3(7 mL)；
将样品pH值调至2.0后加入33 mL胃蛋白酶溶液（0.27 mg/mL 0.1 M HCL），模拟胃消化，置于37℃ 55 rpm依次在振荡1 min、5 min、30 min、60 min时取样P2-1(10 mL)、P2-5(10 mL)、P2-3(10 mL)、P2-60(10 mL)；
将样品pH值调至7.0后加入14 mL胰酶溶液（0.4 mg/mL 20 mM磷酸盐缓冲液）和14 mL猪胆盐溶液（0.4 mg/mL 20 mM磷酸盐缓冲液），模拟人体小肠消化，置于37℃ 120 rpm依次在振荡1 min、5 min、30 min、120 min时取样P2-1(14 mL)、P2-5(14 mL)、P2-3(14 mL)、P2-60(14 mL)。