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模拟人体消化评价乳酸菌发酵豆乳蛋白消化情况(4)
每次取样后采用5 min沸水浴的方法终止样品中的酶消化反应后暂存,在完成一次消化过程后,将样品在4℃ 9800 g 的条件下离心15 min,分别收集上清液和沉淀,保存于-20℃冰箱。
1.2.4 SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE第一次由Shapiro等人提出后,被广泛应用于蛋白质分离实验[13]。在向具有分子筛效应的聚丙烯酰胺凝胶网状结构中引入十二烷基磺酸钠(SDS)后,由于SDS是一种阴离子去污剂,在还原剂(β-巯基乙醇)存在时可以破坏蛋白质亚基之间的非共价键,使其解离成单个亚基,之后按照一定比例与蛋白质分子结合,形成带负电荷的复合物,其负电荷远远超过原先的电荷,相当于消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别,致使电泳迁移率仅仅取决于蛋白质样品相对分子量大小这一因素[14]。
SDS-PAGE电泳所需试剂:
1.5 mol/L Tris-HCL pH8.8(4℃存放)
0.5 mol/L Tris-HCL pH6.8(4℃存放)
10%SDS(室温存放)
30%丙烯酰胺溶液(Acr/Bis)(4℃存放):量取29.2 g Acr,0.8 g Bis,用去离子水定容至100 mL,过滤备用。
10%APS(现配现用)
2×上样缓冲液(室温存放):量取2.0 mL 0.5 mol/L Tris-HCL (pH6.8),2 mL 10%SDS,0.5 mL 0.1%溴酚蓝(BPB),2 mL甘油,1 mL β-巯基乙醇,混匀后,加去离子水(2.5 mL)溶解定容至10 mL。
5×电泳缓冲液(室温存放):称取7.5 g Tris,36.0 g甘氨酸,2.5 g SDS,用400 mL去离子水溶解,充分搅拌溶解,定容至500 mL,使用时用去离子水稀释5倍使用。
考马斯亮蓝R-250染色液(室温存放):量取0.5 g考马斯亮蓝R-250,210 mL95%乙醇,50 mL冰醋酸,搅拌均匀后加去离子水定容至500 mL,用滤纸滤除颗粒物备用。
脱色液(室温存放):量取225 mL 95%乙醇,25 mL冰醋酸,混匀后,加去离子水定容至500 mL备用。
保存液(室温存放):7%冰醋酸
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