西式肉制品中腐败菌的分离鉴定及腐败性能分析(2)
关于低温西式肉制品中微生物的研究，目前主要集中在火腿和香肠，培根方面未见报道。徐宝才等[5]运用传统微生物分离鉴定法研究了牛肉火腿切片腐败微生物及贮藏过程中品质变化，初步鉴定了该产品中的主要腐败微生物是干酪乳杆菌（Lactobacillus. casei）。胡萍等[6-9]综合传统微生物培养、PCR-DGGE指纹技术以及系统发育法等方法分离鉴定不同的真空包装火腿切片产品中的腐败菌发现，米酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）、弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）和明串珠菌属（Leuconostoc sp.）等是存在于该类产品中的主要微生物。国内外有关低温熏煮香肠中腐败微生物的研究有很多，针对性的研究包括乳杆菌属（Lactobacillus sp.）[10-11]、明串珠菌属（Leuconostoc sp.）[12]和芽孢杆菌属（Bacillus sp.）[13]等，白艳红[14]和张春江[15]都对低温熏煮香肠中的主要腐败菌做了研究，结果较为一致，如白艳红通过将API快速鉴定和16S rDNA基因序列分析法相结合用于肉类腐败微生物的快速鉴定，研究了低温熏煮香肠腐败机理及生物抑菌研究，得出该产品中主要腐败菌相为乳酸菌、葡萄球菌、芽胞杆菌等。
针对培根方面研究的欠缺，本文对三种西式肉制品进行了较为全面的腐败菌分离鉴定及腐败能力的分析，以期为西式肉制品的产业链优化提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
四个品牌的培根、火腿和香肠样品共计100份，其中培根33份，火腿45份，香肠22份，购于南京的三家超市。
图1 采样点分布
1．2 试剂与仪器
胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、细菌琼脂粉 青岛高科园海波生物技术有限公司。
氯化钠、磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠 南京化学试剂股份有限公司。
磷酸盐缓冲液（pH 6.2，0.1 M）：0.2 M磷酸二氢钠水溶液81.5 mL中加入0.2 M磷酸氢二钠水溶液18.5 mL，加水定容至200 mL。
用于PCR 扩增的全套试剂和扩增引物，上海生工生物工程技术服务有限公司。
生物安全柜，The Baker Company；400cc BagMixer拍击式均质器，法国Interscience公司；Microfuge 20R高速冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司；Bugbox袖珍式厌氧工作站，英国Ruskinn Technology公司；HPP 260光照培养箱，德国Memmert公司；Mastercycler nexus Thermal Cycler，美国Eppendorf公司；Scan 1200自动影像分析菌落计数仪，法国Interscience公司；Mixing Block MB-102恒温振荡金属浴，杭州博日科技有限公司；SX-500全自动高压灭菌锅，日本Tomy Digital Biology公司。
1．3 方法
1．3．1 样品前处理及取样 将购回的样品置于12 ℃培养箱中，待出现明显的腐败现象（变色、发粘、胀袋等）时取出。无菌操作条件下每份样品取50 g，装入加有80 ml灭菌生理盐水的均质袋中均质，洗脱菌体。
1．3．2 细菌分离 每份样液用接种环蘸取划线于6个TSA平板，有氧培养的平板置于28 ℃的培养箱中培养24 h，厌氧培养的平板置于28 ℃的厌氧操作台内培养36 h。根据每份样品的菌落生长情况，分别挑选出数个长势良好、典型生长的单菌落于TSA平板上划线分离纯化，直至得到最终纯化的单菌落。用放大镜观察菌落特征，并接种单菌落于TSB培养液中，28 ℃培养，有氧条件下24 h，厌氧条件下36 h，得到对数生长期的细菌培养液。
1．3．3 菌落形态观察 观察并记录已分离纯化的单菌落形态，包括菌落的颜色、大小、形状、光泽、边缘、透明度、隆起度、质地、表面状态等。
1．3．4 煮沸法[9]提取细菌基因组DNA 取TSB菌液1 ml，12000 r /min离心5 min富集菌体，弃去上清，加入150 μL无菌水，涡旋混匀，100 ℃金属浴8 min后立即冰浴10 min，10000 r /min 离心5 min，以上清液为模板，－20 ℃保存备用。