西式肉制品中腐败菌的分离鉴定及腐败性能分析(3)
1．3．5 16S rDNA法[16]鉴定腐败菌 以27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) 为引物，聚合酶链式反应(PCR)扩增菌株的16S rDNA基因。反应体系为25 μL：GoTaq Green Master Mix (2×)12.5 μL；上下游引物各1 μL，模板DNA4 μL，加无菌去离子水补至25 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min；结束后4 ℃保温。送至上海生工生物工程股份有限公司测序，测序引物与扩增引物相同，测序长度为1500 bp左右。登陆NCBI（National Center for Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心）网站，将所得序列到网站进行BLAST比对，获得相似性98 %以上的菌株，将菌株的核酸序列用ClustalX2软件进行多重序列比对后，用MEGA5.10软件构建系统发育树。
1．3．6 鸡肉培养基（Cooked-meat Juice Agar）的制作 将鸡胸肉切片(约0.5 cm厚)，在80 ℃水浴锅中煮熟（10 min），剪碎匀浆，纱布滤去肉糜。浆液与琼脂溶液水浴60 ℃保温，混合后倒平板，6 KGy剂量的60Co辐照灭菌。配置琼脂溶液和匀浆时加入的液体为磷酸盐缓冲液（pH 7.2，0.1 M）。培养基中肉的含量为10 %，琼脂含量为0.8 %。
1．3．7 分解圈法测定菌株对肉蛋白的分解能力 调整处于对数生长期的细菌培养液OD600值至0.4左右，取2 μL点样至鸡肉培养基，25 ℃培养，每天测量分解圈的直径大小，用毫米（mm）表示。
2 结果分析与讨论
2．1 细菌菌落特征
本试验共分离鉴定出313个菌株。通过对菌株在TSA平板上的单个菌落形态进行观察，结果如表1。由表可知，分离出的菌株菌落特征各种各样，颜色以白色和黄色为主，形状多为规则，隆起度有平、微隆、低凸，质地有奶油状、湿润、粘稠拉丝的特征，透明度分为不透明、半透明和透明，菌落大小从大到中到小均有出现。此外，不同产品分离出的部分菌株菌落特征相同。