车前草总黄酮提取工艺优化(2)
1.实验部分
1.1实验所用仪器及试剂
材料：车前草（购于同和堂药店）。
试剂及药品：甲醇、无水乙醇、丙酮、蒸馏水、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠等。
实验设备与仪器：格兰仕WD800型微波炉（顺德市格兰仕微波炉电器有限公司）；SHB-III循环水式真空泵（郑州欧卡仪器设备有限公司）；可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）；电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。
1.2车前草总黄酮微波辅助提取及含量测定
微波辅助提取技术是利用其产生的高频电磁波辐射所要提取的物质，在交频电场﹑磁场作用下，提取物质的极性分子的取向会随着电场方向的改变而发生变化，会导致分子振动、旋转，从而加剧反应物分子间的碰撞，使分子在非常短的时间内活化。因此，微波可以促使细胞壁和细胞膜破坏，有利于细胞内物质渗出，故其能够迅速而有效的提取植物类的有效成分[12-13]。
1.2.1车前草总黄酮标准曲线绘制的原理[14]
亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠体系分光光度法是被一些药典所采用的最常用的总黄酮测定方法，这种方法以NaNO2-Al(NO3)3为显色剂，利用其与黄酮类物质生成的红色铝螯合物为特征，在510 nm波长处测定其吸收光谱，并以芦丁为标准品进行对照，从而得到待测物质的总黄酮含量。
1.2.2芦丁标准溶液的配制
准确称取芦丁10 mg（120°C烘至恒重），置于100 mL容量瓶中，用60%的乙醇溶解并定容，得浓度为0.1 mg/mL的标准液备用。
1.2.3绘制标准曲线
精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的芦丁标准液分别置于具塞试管中，各加30%乙醇使成5 mL，然后分别加入5% NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加4% NaOH溶液4 mL，用蒸馏水定容至10 mL，放置15-20 min，在510 nm波长处测定吸光度。每个浓度做三个平行实验，取平均值，作标准曲线（图1）。以吸光值对浓度进行线性回归分析，求得回归方程：y =13.257x -3.1×10-3 R2 = 0.9998。
图1 总黄酮含量测定的标准曲线
1.2.4车前草总黄酮含量的测定
取1 mL稀释样品液于具塞试管中，分别加入4 mL 30%乙醇使成5 mL，然后分别加入5% NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加4% NaOH溶液4 mL，用蒸馏水定容至10 mL，放置15-20 min，在510 nm波长处测定吸光度。根据回归方程算出测量液中总黄酮的浓度C（mg/mL），按照以下公式计算提取物黄酮的含量（mg/g）。
提取率（mg/g）＝CVN/W
式中：C－测量液总黄酮浓度（mg/mL）；V－粗提液体积（mL）；N－稀释倍数；W－原料干重（g）。
2.结果与分析
2.1单因素实验
2.1.1提取剂对车前草总黄酮提取率的影响
称取车前草4份，每份2 g，在室温下分别加入50 mL的80%甲醇﹑80%乙醇﹑80%丙酮﹑80%蒸馏水做提取剂。微波技术能够应用于植物细胞破壁[15]，有效地提高了提取率。微波提取两次，中火各2 min，合并提取液，加相应溶剂定容至100 mL，510 nm测吸光度。
图2 不同提取剂对车前草总黄酮提取率的影响
由图2可知，利用乙醇做提取剂时，车前草总黄酮提取率达19.7 mg/g，其远远优于甲醇，丙酮，蒸馏水，故选乙醇做提取剂。
2.1.2溶剂浓度对车前草总黄酮提取率的影响
称取车前草5份，每份2 g，在室温下，分别加入50 mL的30%、45%、60%、75%、90%的乙醇于锥形瓶中，中火2 min微波提取两次，合并提取液，加相应提取剂定容至100 mL，510 nm测定吸光度。
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