金霉素的水生生物毒性评价(6)
3.2 金霉素储备液配制
本实验使用浓度为1000 ppb、1500 ppb和5000 ppb、2250 ppb四种不同浓度的金霉素储备液。以1000 ppb储备液的配制方法为例，其余浓度的储备液的配置方法与此类似，只是所称取得金霉素质量和移取的纯净水体积不同。
用分析天平称取0.005 g金霉素于灭菌烘干后的容量瓶中，用移液枪加入5 ml纯净水后置入超声波仪内用超声波加速金霉素溶解，既得1000 ppb的储备液。
注意：用超声波仪加速溶解5000 ppb的储备液时不可时间过久，否则会形成乳液。
3.3 铜绿微囊藻细胞密度与吸光度关系测定
配制一定吸光度梯度藻液后，测定在不同吸光度下藻液细胞个数，即用血球计数板在显微镜下对上述藻液进行细胞计数，数中央、左上、左下、右上、右下5个方格内的细胞个数，通过换算做出藻细胞吸光度与藻细胞个数关系的标准曲线。
3.4 实验藻样的接种与处理
本次实验接种藻样的浓度范围为0.04~0.07的吸光度。藻液接种于50ml三角锥形瓶中，总体积为20~50 ml。
（1） 藻液接种
先用紫外－可见光分光光度仪测定初始接种藻液的吸光度，根据所测得的吸光度确定接种藻液的稀释倍数即取少量原藻测其吸光度，加培养液稀释后测其吸光度，直至其吸光度控制在0.04~0.07范围内时确定其稀释比例。确定稀释倍数及接种藻液总体积后，用移液枪移取一定量的藻液于灭菌烘干后的50ml三角锥形瓶内，根据稀释倍数加入一定量培养液。
（2） 接种藻液染毒
对接种藻液进行0 ppm、1 ppm、2 ppm、5 ppm、10 ppm、20 ppm浓度梯度的金霉素溶液处理，每个浓度设置3个平行，并设置一组未经金霉素溶液处理的接种藻液作为空白样。将装有经上述处理藻液的三角锥形瓶放入恒温培养箱中进行12小时昼夜循环培养。培养48h后，在48~72h时间范围内用酶联免疫法测定微囊藻毒素的含量。
（3）染毒0h的接种藻液吸光度及藻细胞浓度测定
取定容后的接种藻液摇匀后用紫外-可见分光光度仪测定其吸光度。根据其吸光度及实验前所测定绘制的藻细胞吸光度与藻细胞密度关系标准曲线计算染毒0h后接种藻液的细胞密度。
（4）注意事项
注意藻液接种及染毒顺序：先加入培养液于三角锥形瓶内，再移取适量原藻液，最后用移液枪加入上述浓度梯度的金霉素溶液。
3.5 染毒培养48h后接种藻液吸光度及藻细胞浓度
在测定微囊藻毒素含量的同时用可见—紫外分光光度计对染毒两天后的试样进行吸光度测定，所得数据通过查实验前测定的藻液吸光度-细胞密度标准曲线来确定细胞密度值。
注意：测定染毒48h后的接种藻液吸光度所用比色皿要与测定染毒0h时所用的比色皿一致，否则误差可能会很大。
3.6 染毒48h后藻液细胞外微囊藻毒素的提取
使用灭菌后的注射器抽取一定量培养48h后的染毒藻液后用0.45µm的针头过滤器过滤，过滤出的液体即为细胞外微囊藻毒素提取液。将滤液注入离心管中，待后续稀释、测定。
3.7 染毒后48h藻液细胞内和细胞外总微囊藻毒素提取
染毒后藻液细胞内和细胞外总微囊藻毒素提取：○1取30 ml左右培养48h后的染毒藻液于50 ml小烧杯中；○2将小烧杯放入细胞粉碎机内破碎20 min；○3从细胞粉碎机内取出小烧杯后用灭菌后的注射器抽取一定量经细胞破碎后的藻液用0.45 µm针头过滤器过滤，滤液即藻液为细胞内和细胞外总微囊藻毒素，将其注入离心管中后放入冰箱待后续稀释、测定。
3.8 微囊藻毒素（MC-LR）含量的测定
本实验采用间接酶联免疫法（Indirect ELISA）测定藻毒素含量。其中用间接酶联免疫法测定染毒48h后细胞外微囊藻毒素含量的原理、方法、实验过程及计算方法与染毒后48h后藻液细胞内和细胞外总微囊藻毒素含量相同。