金霉素的水生生物毒性评价(8)
（2） 酶联免疫法实验步骤
○1将包被反应板取出，平衡至室温；
○2移取48个微孔放置反应板上，用稀释好的洗涤液清洗2次，并设定1号孔为酶标仪调零孔，2-7号为微囊藻毒素标准对照孔，其余为样品孔，进行编号；
○31号孔加入50 µL的PBS稀释液，2-7号孔分别加入50 µL系列浓度（0 ppb、0.1 ppb、0.25 ppb、0.5 ppb、1.0 ppb、2.0 ppb）的标准品，其余孔加入相应的样品提取液；
○41号孔内加入50 µL抗体稀释液，在其他所有微孔中加入50 µL第一抗体溶液，轻轻振摇，使各孔中反应物混匀后，在恒温水浴锅内37℃，恒温孵育60分钟；
○5倒掉板中液体，每孔加入约250 µL洗涤液，洗液不得溢出，放置1分钟后，甩掉洗液，在吸水纸上拍干，重复洗涤3次；
○6洗涤后，每孔加入100 µL配制好的酶标二抗溶液，在恒温水浴锅内37℃，恒温孵育30分钟；
○7倒掉板中液体，每孔加入250 µL洗涤液，洗液不得溢出，放置1分钟后，甩掉洗液，在吸水纸上拍干，重复洗涤5次；
○8在每个小孔内加入50 µL底物液后，再加入50 µL显色液，混匀，37℃恒温水浴锅中显色15分钟后，在每个微孔中加入50 µL反应终止液 ；
○9轻轻摇动微孔板，30分钟内在450 nm处读取光密度值（OD值）。
（3） 染毒48h的接种藻液吸光度及藻细胞浓度
从光照培养箱中取染毒48h后的接种藻液用紫外-可见分光光度计测定其吸光度。根据其吸光度及实验前所测定绘制的藻细胞吸光度与藻细胞密度关系标准曲线计算染毒48h后接种藻液细胞密度。
（4） 注意事项
注意微囊藻毒素酶联免疫快速检测试剂盒的检测范围是0~4 μgL-1其检测限制是0.05 μgL-1。经多次实验反复检测发现，检测出的染毒后藻液中微囊藻毒素的检测值超出了试剂盒检测范围，需要用PBS稀释液对微囊藻毒素提取液进行一定倍数的稀释后再用间接酶联免疫法测定染毒藻液中微囊藻毒素的含量。
3.9 实验数据分析
3.9.1 藻液吸光度和藻细胞密度标准曲线
吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关，只要在确定光波长的情况下同一种物质的吸光系数就不会改变。根据比尔-朗伯定律，吸光度与被测物质的物质的量浓度成正比。而经研究表明，铜绿微囊藻细胞密度与藻液吸光度成正比，故可通过测量藻液的吸光度来估算藻液中藻细胞密度。为此我们可用血球计数板法测定在不同吸光度下的藻细胞密度后拟合出一条藻液吸光度—藻细胞密度标准曲线。藻细胞个数的统计采用血球计数板法，即用血球计数板在显微镜下数中央、左上、左下、右上、右下5个方格内的细胞个数通过式1.1计算，式中N表示五个方格中细胞总数。
计数公式：藻细胞数/L=N/100*10^12 1.1
通过上述显微镜计数并在680 nm处测定吸光度，建立不同藻细胞浓度下的藻细胞数量与吸光度之间的线性关系，具有良好的相关度， 。其线性关系为： ，见下图3。
图3 藻液吸光度-藻细胞密度标准曲线
（1） 染毒0h后接种藻液的藻细胞密度：根据0h时测定吸光度及实验前所测定绘制的藻细胞吸光度与藻细胞密度关系标准曲线计算染毒0h后接种藻液细胞密度。
（2） 染毒48h后接种藻液的藻细胞密度：根据48h测定吸光度及实验前所测定绘制的藻细胞吸光度与藻细胞密度关系标准曲线计算染毒48h后接种藻液细胞密度。
图4 染毒0h接种藻液细胞浓度与染毒48h接种藻液藻细胞密度对比图