金霉素的水生生物毒性评价(7)
关于微囊藻毒素的检测，国内外学者在这方面做了大量的研究工作，建立了多种检测方法。主要的检测方法有生物测试法、细胞毒素检测技术、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC-MS）、酶联免疫法（ELISA）、蛋白磷酸酶抑制分析法等。上述各种方法的比较见下表3。
表3 微囊藻毒素监测方法比较
检测技术 优点 缺点 最小检测限
生物测试法 操作简单，结果直观、
快速，可检测未曾发生的新毒素 消耗较多的毒素、灵敏度和专一性不高；无法准确定量，不能辨别毒素的异构体类型 半致死量和致死量来衡量
细胞毒素检测技术 可获得高灵敏度、建立的细胞系可方便实验 生产工作量大 10~20 ng/ml
高效液相色谱法（HPLC） 对不同毒素可进行精确的定性和定量 灵敏度较低、毒素需预处理、技术含量高，价格昂贵，各实验室的检测程序和条件差别大 1ng/ml
气相色谱法（GC-MS） 快速、准确、灵敏度高，可以测定不同的MC的异构体 技术含量高、操作复杂、需要标准毒素、前处理过程复杂 1ng/ml
酶联免疫分析法（ELISA) 可检测到毒素的不同同系物，商品试剂盒的出现大大方便了操作，灵敏度高 对多种同系物的识别需要广谱抗体 0.20ng/ml
蛋白磷酸酶抑制分析法 反映各种毒素的总量，检测灵敏度高而且测定时间较短、干扰较小，灵敏度更高 不能区分特异性的同系物、需要新制备的放射性底物、放射性废物的处理困难 2.5ng/ml
从本实验室的实验条件以及实验时间等方面的要求考虑，并综合所查文献，最终决定采用间接酶联免疫法进行本次实验中微囊藻毒素含量测定。
3.8.1 间接酶联免疫法（Indirect ELISA）原理
本实验使用间接酶联免疫吸附法（Indirect ELISA）测定试样藻毒素的浓度，这一方法的基本原理（下图）是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。此测定方法可达很高的灵敏度。
图2 酶联免疫法原理图
3.8.2 间接酶联免疫法（Indirect ELISA）实验过程
（1） 实验前准备
○1洗涤液配制：浓缩洗涤液用纯净水稀释20倍，使用前稀释；○2PBS稀释液的配制：浓缩PBS溶液用纯净水稀释10倍，使用前稀释；○2第一抗体配制：取1瓶MC-LR第一抗体冻干粉，准确加入4.0 mL抗体稀释液，混匀，配制成实验中使用的MC-LR第一抗体溶液，使用前配制；○4酶标二抗配制：取1瓶酶标二抗冻干粉，准确加入5.5 ml或5.2 ml抗体稀释液（不同批次的试剂盒因酶标二抗冻干粉量不同而导致抗体稀释液加入量可能不同），混匀，配制成实验中使用酶标二抗溶液，使用前15分钟配制；○5实验前凡实验所需用品均需高温高压灭菌或用75%乙醇灭菌半天。