火腿烤鸭中水溶性提取物分离技术的研究(6)
参考杨燕军，陈有亮（2005）的方法及参数[14]，利用水提法提取样品中的水溶性物质。将前处理好的样品浸泡于无水乙醚中，静置24 h。24 h后将样品捞出洗净，置于蒸馏水中，加水量为1:3，在80℃下水浴12 h。用吸管将水煮液上层的油脂吸走。将样品捞出，用纱布过滤水煮液，同时将样品用纱布包裹，将样品中保留的液体挤出，与过滤后的水煮液合并，得到粗滤液。反复以上步骤数次，尽可能得较为纯净的提取物。将样品粗提液分批倒入蒸发瓶中进行旋转蒸，在蒸发的过程中温度从50℃逐渐升高到90℃，直至浓缩滤液至浸膏状，即为样品粗提物。冷却后置于4℃冰箱保存。
2.2.3 分离纯化实验
2.2.3.1 超滤
火腿、烤鸭的水溶性浓缩物在压力的驱动力下流经超滤膜的表面，溶液中大于膜微孔孔径的物质被截留下来，小于膜微孔孔径的物质则透过膜，为了除去样液中的悬浮物、胶体、细菌以及一些大分子物质，故而进行超滤。具体方法如下：
将超滤的机器反复用蒸馏水清洗。分别用电子天平取10g样品粗提物，加入1.5 L的蒸馏水，搅拌均匀。将粗提物溶解液加入超滤机，进行超滤。超滤膜孔径5000Da。用蒸馏烧瓶收集超滤液。利用旋转蒸发仪在温度为90℃的条件下对样品进行浓缩。
2.2.3.2 凝胶层析
为了使超滤过后的火腿、烤鸭的水溶性浓缩物中分子大小不同的物质的得到分离，故而进行凝胶层析分离。具体方法如下:
用电子天平称取一定量凝胶粉于烧杯中，加以适量的洗脱液，沸水浴溶胀2个小时。加入搅拌均匀的凝胶浆液于干净的层析柱内，打开出口，控制流速，使凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部。不断补充凝胶浆液至胶面上升至层析柱上部，调节流速。打开上接头，用吸管吸去床面上大部分的洗脱液，当洗脱液面接近凝胶床面时，关闭层析柱出口端，用吸管吸取样品混合液若干毫升，沿管壁小心加样于柱床表面，打开层析柱出口端，待样品完全渗入胶内，开始收集流出液，同时小心加满洗脱液，连接好层析柱上头，通过泵来控制流速。
2.2.4 体外抗氧化活性的测定
采用总还原力的测定和DPPH清除率的测定两种方法，对具有特色的中国传统美食——火腿和烤鸭进行体外抗氧化性的测定。
2.2.4.1总还原力的测定
准确量取不同浓度（0.25%、0.5%、1%、2%、4%）2.5ml的样品溶液，加入2.5ml磷酸缓冲液（0.2mol/L, pH6.6）和2.5ml 1%的铁氰化钾溶液。将其样品置于在50℃水浴反应20min后冷却至室温，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸终止反应，摇匀后使其在转速为3000 r/min的状态离心10 min，取5 mL的上清液，接着依次加入5 mL蒸馏水及1 mL 0.1%的三氯化铁。混合均匀后，静置10 min，然后于700 nm波长下测其吸光度。所测出的吸光值越大，表示还原力越强[15]。
2.2.4.2 DPPH 自由基( DPPH•) 清除率的测定
称取0.0394g DPPH溶解于100mL乙醇并定容，摇匀，作为储备液（l.0x10-3 mol/L)避光保存于冰箱，用时逐级稀释(乙醇溶解)。取待测样品2 mL及浓度为l.0x10-4 mol/ L DPPH溶液2 mL先后加入同一具塞试管中，摇匀，在黑暗中室温放置30 min，以乙醇为空白在517 nm测定其吸光度Ai。取2 mL的乙醇与浓度为l.0x10-4 mol/L的DPPH溶液2 mL混合，摇匀，在黑暗中室温放置30 min，以乙醇为空白在517nm测定其吸光度A0。取2 mL待测样品与2 mL无水乙醇混合,摇匀,在黑暗中室温放置30 min，以乙醇为空白在517 nm测定其吸光度Aj[16]。
根据下列公式计算提取液对DPPH的抑制率，即
抑制率/% =[1-(Ai-Aj)/Ao]×100 （2.1）