快速测定水解酶活性的新方法研究(5)
腈水解酶及其产生菌还可用于电镀厂等腈污染废水的生物治理[19]，因此具有重要的工业应用价值。但目前商品化的酶源非常缺乏，限制了腈水解酶的工业应用，因此大规模开展腈水解酶的筛选工作十分必要。
1.4.3 腈水解酶的筛选方法研究现状
为了扩大腈水解酶酶源，建立一个快速的筛选方法是十分重要的。在过去的50年里，许多筛选策略应用于腈水解酶的筛选。Happer[20]在研究中提出的TLC 法方法简单并且快速，但是通量低。Santoshkumar[21]报道利用平板法测定产酶菌株催化脂肪族腈过程中释放出氨引起体系中pH 变化而进行腈水解酶的筛选，由于体系中存有缓冲溶液，生成的弱酸或弱碱对pH 变化影响小，因而检测不敏感, 并不适合大批量的筛选。DeSantis[22]报道一种以金属离子为基础的方法，这种方法当浓度低于5.0 mmol/L时无法通过指示器的背景信号检测。但是，由于背景是由蛋白质引发的，所以不能应用在发酵或其他复杂系统中。Zhu[23]等人提出了一个新颖的时间分辨的荧光探针法，并且在96孔板中进行检测。由于时间分辨的荧光的属性，背景在其他蛋白质的测定中可以减少，且灵敏度也有了提高。然而，这个方法只能用于测定o-羟基-苯甲腈及其衍生物的腈水解酶，但在应用方面受到限制，不能作为普遍的高通量筛选方法来测定腈水解酶。综上可以看出，这些方法在应用于许多复杂的筛选系统时是有些不足的，新的筛选策略的建立仍然是值得研究的课题。
1.4.4 测定羧酸含量的方法的比较
腈水解酶可催化腈经一步水解反应生成相应的羧酸。通过测定转化液中羧酸的含量，可以判定水解酶的活性。因此选择一个合适的测定羧酸含量的方法也是很重要的。有机酸的测定方法有很多，主要包括电位滴定法、气相色谱法、液相色谱法等。
电位滴定法是在滴定过程中通过测量电位变化以确定滴定终点的方法，靠电极电位的突跃来指示滴定终点，在滴定到达终点前后，滴液中的待测离子浓度往往连续变化n个数量级，引起电位的突跃，被测成分的含量仍然通过消耗滴定剂的量来计算，对于有机酸的测定来说电位滴定法易受溶液中其它酸性物质的干扰，测定结果不够准确。
气相色谱法是以气体作流动相的色谱分离法，它的分离机理也是基于物质在流动相和固定相两相间分配的不同而导致分离。气相色谱的优点是高选择性、高灵敏度和高分离效率，确定在于在定量分析时，常需要用已知物纯样品对检测后输出的信号进行校正，并且主要是用于特定的有机酸的测定，不适合有机酸总量的测定。
高效液相色谱法以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶液或不同比例的混合溶液、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。但高效液相色谱法在测有机酸含量时操作较复杂、费时。
以上提到的一些测定方法都有各种不足之处，因此确立一个简单、准确且快速的测定羧酸的方法也是十分必要的。Takeuchi等人[24]提出报告说在水溶液中的羧酸可以通过羟肟酸铁分光光度法测定，尽管这种方法是灵敏的，但实验在室温下是不能进行的。Kasai等人[25]提出报告说水溶液中的羧酸在氯化羟胺（HA）和N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）的存在下经一步反应生成羟肟酸，可利用分光光度法进行测定，尽管此方法可用于测定各种羧酸，但是显色温度必须在50℃以上。
1.5 本课题研究的意义及思路
1.5.1 本课题研究的意义
为了建立一种简单、快速且适用范围广的测定酶活性的方法，近几来也有一些相关的研究对之前的方法进行改进。牛金刚等人[26]利用水溶液中的羧酸在羟胺和N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）存在的条件下反应生成羟肟酸，并和酸性高氯酸铁反应生成紫红色羟肟酸铁络合物的现象，采用分光光度法测定了水溶液中的有机酸含量。何玉财等人[27]的研究提出在室温下可利用改进的羟肟酸铁比色法建立腈水解酶高通量筛选方法，高氯酸羟胺（HAP）和DCC与有机羧酸溶液反应生成羟肟酸，然后羧酸与酸性氯化铁溶液进行显色反应，研究也发现，此方法也适合其他有机羧酸（丙烯酸、烟酸、羟基乙酸、苯甲酰甲酸和苯乙酸等）的检测。以上的方法具有仪器简单、线性范围较宽等优点，但是，试验中所用的高氯酸羟胺需要自制，制备过程中产物分离较困难，而且工艺过程中使用大量易燃的有机溶剂，操作需十分小心，并且得到的高氯酸羟胺的纯度难以保证。本文将对之前的研究方法进行改进和优化。
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