快速测定水解酶活性的新方法研究(7)
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表3.2 主要仪器表
3.2 试验方法
3.2.1 紫外-可见扫描确定最适检测波长
紫外-可见分光光度法是根据物质分子对波长为200-760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。操作简单、准确度高、重现性好。分光光度测量是关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。
为了确定合适的检测波长，用Uv-vis TU190分光光度计对标样(10 mmol/L)溶液在波长350-850 nm之间进行波长扫描。
3.2.2 优化影响显色反应的条件
(1) N,N'-二环己基碳二亚胺浓度对显色反应吸光度的影响
先取10mmol/L标样酸的水溶液1mL准确移入5mL的圆底离心管，依次加入4mmol/L盐酸羟胺的乙醇溶液3mL，在1-8号和1’-8’号离心管中分别加入浓度为0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7mol/L的DCC的乙醇溶液于体系，充分混匀后在60℃水浴锅内水浴30min，30min后取出全部离心管，冷却至室温（室温放置约10min），最后分别向离心管中加入0.3mol/L氯化铁的乙醇溶液50μL，混匀，在室温下反应5min，于500nm波长处测定吸光度值。
(2) 盐酸羟胺浓度对显色反应吸光度的影响
在最佳显色反应条件下，先取10mmol/L标样酸的水溶液1mL准确移入5mL的圆底离心管，配置浓度分别为2,3，4，5，6，7，8mmol/L的盐酸羟胺的乙醇溶液加入1-7号和1’-7’号离心管，再加入0.2mol/L DCC的乙醇溶液200μL于体系中，充分混匀后在60℃水浴锅内水浴30min，30min后取出全部离心管，冷却至室温（室温放置约10min），最后分别向离心管中加入0.3mol/L氯化铁的乙醇溶液50μL，混匀，在室温下反应5min，于500nm波长处测定吸光度值。
(3) 氯化铁浓度对显色反应吸光度的影响
在最佳显色反应条件下，先取10mmol/L标样酸的水溶液1mL准确移入5mL的圆底离心管，依次加入4mmol/L盐酸羟胺的乙醇溶液3mL，0.2mol/L DCC的乙醇溶液200μL于体系中，充分混匀后在60℃水浴锅内水浴30min，30min后取出全部离心管，冷却至室温（室温放置约10min），再加入浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0mol/L的氯化铁的乙醇溶液于1-10号和1’-10’号离心管中，混匀，在室温下反应5min，于500nm波长处测定吸光度值。
(4) 反应时间对显色反应吸光度的影响
在最佳显色反应条件下，先取10mmol/L标样酸的水溶液1mL准确移入5mL的圆底离心管，依次加入4mmol/L盐酸羟胺的乙醇溶液3mL，0.2mol/L DCC的乙醇溶液200μL于体系中，充分混匀后在60℃水浴锅内水浴30min，30min后取出全部离心管，冷却至室温（室温放置约10min），最后分别向离心管中加入0.5mol/L氯化铁的乙醇溶液50μL，混匀，1-8号和1’-8’号离心管分别在室温下反应5，10，15，20，25，30，35，40min，于500nm波长处测定吸光度值。
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