快速测定水解酶活性的新方法研究(6)
1.5.2 本课题研究的思路
本文中将高氯酸羟胺改用为盐酸羟胺，将成本较高的高氯酸铁改用为氯化铁，简化了操作，降低了成本，提高了安全性和结果的准确性。并且本文对影响显色反应的各个因素进行了优化，包括N,N'-二环己基碳二亚胺浓度、盐酸羟胺浓度、氯化铁浓度、反应时间以及水浴时间等方面，并且对试验的抗干扰性进行测定，从而建立最适的显色条件并制作标准曲线。利用分光光度法对水解酶活性进行测定，并且将得到的结果与高效液相色谱法检测的结果进行对比，由此来验证此方法的准确性。
2 实验原理及流程
2.1 实验原理
本研究中，利用盐酸羟胺和N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）与被腈水解酶催化腈类得到的有机羧酸溶液反应生成羟肟酸，然后羟肟酸与酸性氯化铁溶液反应生成紫红色羟肟酸铁络合物（图2.1），因此可利用紫外分光光度法测量显色溶液吸光度，来判断羧酸溶液的浓度。
图2.1分光光度法测量腈水解酶活性反应机制
2.2 实验流程
本论文研究的方法主要用于测定水解酶的活性，在测细胞酶活之前要对会影响显色反应的因素进行优化，选取显色反应的最适宜条件，从而应用与实际的测量当中。
测定水解酶活性之前是筛菌的过程，主要流程如下：
水浴时间优 化 ← 反应时间优 化 ← 氯化铁浓度优化 ← 盐酸羟胺浓度优 化 ← DCC浓度
优化↓分光光度法测定酶 活
图2.2实验主要流程图
3 试验方法与材料
3.1 实验材料
3.1.1 工程菌种子培养基
蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl 5g/L
称1g 蛋白胨, 0.5g酵母浸膏,0.5g NaCl，加100mL双蒸水，于500mL的锥形瓶中，调pH7.0，报纸包装，121℃高压灭菌20min。
3.1.2 发酵培养基
蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl 5g/L
称1g 蛋白胨, 0.5g酵母浸膏,0.5g NaCl，加100mL双蒸水，于500mL的锥形瓶中，调PH7.0，报纸包装，121℃高压灭菌20min。
3.1.3 主要试剂
表3.1 主要试剂表
试剂 级别 生产厂家
无水乙醇 AR 上海凌峰化学试剂有限公司
N,N'-二环己基碳二亚胺 CP 国药集团化学试剂有限公司
盐酸羟胺 AR 上海凌峰化学试剂有限公司
三氯化铁 AR 上海凌峰化学试剂有限公司
二甲基亚砜 AR 国药集团化学试剂有限公司
无水甲醇 AR 上海凌峰化学试剂有限公司
氯化钠 AR. 江苏强盛化工有限公司
蛋白胨 中科昆虫生物技术开发有限公司
酵母膏 中国医药(集团)上海化学试剂公司
氨苄青霉素 国药集团化学试剂有限公司
诱导剂IPTG 生工生物工程（上海）股份有限公司
磷酸缓冲液 自配溶液
3.1.4 主要仪器
名称 型号 生产厂家
洁净工作台 上海汇龙仪表电子有限责任公司
紫外可见分光光度计 7504 上海菁华科技仪器有限公司
电子天平 AL104 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司
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