快速测定水解酶活性的新方法研究(8)
(5) 水浴时间对显色反应吸光度的影响
在最佳显色反应条件下，先取10mmol/L标样酸的水溶液1mL准确移入5mL的圆底离心管，依次加入4mmol/L盐酸羟胺的乙醇溶液3mL，0.2mol/L DCC的乙醇溶液200μL于体系中，充分混匀后在60℃水浴锅内水浴，1-6号和1’-6’号离心管分别水浴5，10，15，20，25，30 min，按时间依次取出离心管，冷却至室温（室温放置约10min），最后分别向离心管中加入0.5mol/L氯化铁的乙醇溶液50μL，混匀，在室温下反应10min，于500nm波长处测定吸光度值。
3.2.3 试验的抗干扰性测定
（1） 盐酸浓度对显色反应的影响
在最佳显色反应条件下，先取10mmol/L标样酸的水溶液1mL准确移入离心管，依次加入4mmol/L盐酸羟胺的乙醇溶液3mL，0.2mol/L DCC的乙醇溶液200μL，再在1-5号和1’-5’号离心管中加入浓度分别为0，0.5，1.0，1.5，2.0mol/L的盐酸溶液1mL于体系中，充分混匀后在60℃水浴锅内水浴15min，15min后取出全部离心管，冷却至室温（室温放置约10min），最后分别向离心管中加入0.5mol/L氯化铁的乙醇溶液50μL，混匀，在室温下反应10min，于500nm波长处测定吸光度值。
（2） DMSO浓度对显色反应的影响
在最佳显色反应条件下，先取10mmol/L标样酸的水溶液1mL准确移入离心管，依次加入4mmol/L盐酸羟胺的乙醇溶液3mL，0.2mol/L DCC的乙醇溶液200μL，再在1-5号和1’-5’号离心管中加入浓度分别为0，0.5，1.0，1.5，2.0mol/L的DMSO溶液1mL于体系中，充分混匀后在60℃水浴锅内水浴15min，15min后取出全部离心管，冷却至室温（室温放置约10min），最后分别向离心管中加入0.5mol/L氯化铁的乙醇溶液50μL，混匀，在室温下反应10min，于500nm波长处测定吸光度值。
3.2.4 标准曲线的绘制
在最佳显色条件下，分别配置1，2,3,4,5,6,7,8,9，10mmol/L标样酸的水溶液，依次加入4mmol/L盐酸羟胺的乙醇溶液3mL，0.2mol/L DCC的乙醇溶液200μL于体系中，充分混匀后在60℃水浴锅内水浴15min，15min后取出全部离心管，冷却至室温（室温放置约10min），最后分别向离心管中加入0.5mol/L氯化铁的乙醇溶液50μL，混匀，在室温下反应10min，于500nm波长处测定吸光度值。
3.2.5 加标回收率
体系1：
取50mmol/L的加腈转化液100μL于5mL的离心管中，再加入0.0012g（70mmol/L）的底物酸，再加入3.9mL双蒸水于离心管中。（稀释40倍）
取1mL上述混均液于体系中，依次加入4mmol/L盐酸羟胺的乙醇溶液 3mL，0.2mol/L DCC的乙醇溶液200μL于体系中，充分混匀后在60℃水浴锅内水浴15min，15min后取出全部离心管，冷却至室温（室温放置约10min），最后分别向离心管中加入0.5mol/L氯化铁的乙醇溶液50μL，混匀，在室温下反应10min，于500nm波长处测定吸光度值。
体系2：
取50mmol/L的加腈转化液100μL于5mL的离心管中，再加入3.9mL双蒸水于离心管中。
取1mL上述混均液于体系中，依次加入4mmol/L盐酸羟胺的乙醇溶液 3mL，0.2mol/L DCC的乙醇溶液200μL于体系中，充分混匀后在60℃水浴锅内水浴15min，15min后取出全部离心管，冷却至室温（室温放置约10min），最后分别向离心管中加入0.5mol/L氯化铁的乙醇溶液50μL，混匀，在室温下反应10min，于500nm波长处测定吸光度值。
空白1：不加酸的水溶液
空白2：100μL的不加腈转化液于5mL的离心管中，再加入3.9mL双蒸水于离心管中。
取1mL上述混均液于体系中，依次加入4mmol/L盐酸羟胺的乙醇溶液 3mL，0.2mol/L DCC的乙醇溶液200μL于体系中，充分混匀后在60℃水浴锅内水浴15min，15min后取出全部离心管，冷却至室温（室温放置约10min），最后分别向离心管中加入0.5mol/L氯化铁的乙醇溶液50μL，混匀，在室温下反应10min，于500nm波长处测定吸光度值。
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