双鼠李糖脂对癌细胞的抑制作用的研究(6)
微量元素液（g•L-1）：CuSO4•5H2O 0.5，MnSO4•H2O 0.5，NaMoO4•2H2O 0.06，H3BO3 0.26，ZnCl2•7H2O 0.7；加入去离子水至1L，使用H2SO4调节pH值至7.0±0.2后用0.22μm的滤膜过滤除菌，室温保存。
④LB培养基（g L-1）：蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10。
2.2 实验方法
2.2.1 鼠李糖脂发酵
2.2.2.1 种子培养方法
斜面种子培养：将 P. aeruginosa M14808斜面划线培养，36℃，恒温培养箱培养，约48h后移入4℃冰箱中保存；
配制体积为1000mL的种子培养基，等量装入3个1000mL锥形瓶中，灭菌；将已斜面培养好的P. aeruginosa M14808，接种至种子培养基中，二次扩大培养，培养条件摇床28℃，180r•min-1，振荡培养2-3d。
2.2.2.2 摇瓶发酵培养方法
配制体积为1000mL的发酵培养基，等量装入3个1000mL锥形瓶中，灭菌；将2.2.2.1已扩培的P. aeruginosa M14808无菌转移至各发酵培养基中培养，培养条件摇床36℃，200r•min-1，振荡培养10d。（扩配的培养液做提取色素的处理）。
2.2.2 鼠李糖脂的分离纯化
发酵结束后，将发酵液在4℃、转速为8000r•min-1的条件下离心20min除去菌体及表面油层，上清液用盐酸将pH值调至2.0，放入4℃的冰箱中静置，过夜。次日，将上清液在4℃、转速为10000r•min-1的条件下离心30min，得上清液。将上清液和氯仿：甲醇（2:1）以等体积萃取，收集有机相，经45℃旋蒸后得鼠李糖脂粗产物。
将粗产物过硅胶柱，先以氯仿进行洗脱，直至无色，再以氯仿甲醇9:1的比例进行洗脱，依次至洗脱完全。所得产物进行薄层层析并分析Rf值，单鼠李糖脂约在0.5左右，双鼠李糖脂约在0.3左右，找出符合的组分，旋蒸得较纯的鼠李糖脂产物。
2.2.3 MTT抗肿瘤研究
2.2.3.1 MTT检测原理
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在490nm波长检测OD值，便可得知活细胞数。
2.2.3.2. MTT溶液的配制
MTT 0.5g，溶于100mL的磷酸缓冲液（PBS）中，用0.22μm滤膜过滤去除溶液中的细菌，配制5mg•mL-1浓度的MTT溶液，放于4℃避光保存。在配制和保存过程中，容器用锡箔纸包住。
其中磷酸缓冲液PBS：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4•2H2O 0.24g，调pH值为7.4，定容至1L。
2.2.3.3 MTT实验步骤
（1）细胞培养：从-80℃的低温冰箱中取出冷冻管，放入37℃温水中快速解冻，取1mL转入培养瓶中，加5mL完全培养液（89%的1640（或高糖培养基）+10%的胎牛血清+1%的双抗），在5% CO2、37℃的饱和湿度下培养(MCF-7用高糖培养基)；
（2）细胞传代：吸出旧液，用2mL PBS洗涤剩余旧液，重复2~3次,以保证去除残留液中余留的死细胞，血清等；
(3)加入1mL一倍浓度的胰酶，振荡消化后吸走胰酶，轻拍培养瓶使细胞落下；加2~3mL完全培养液，用枪吹几下，使细胞落入培养液，分装或弃去一部分培养液，加5ml完全培养液；
（3）铺板：用枪吸走培养瓶中旧液，用PBS润洗，枪轻吹，弃去PBS，吸取1mL胰酶，振荡消化后弃去胰酶，用力拍打瓶壁，使细胞下落，加3mL完全培养液，用枪反复吹使细胞分别均匀，吸取100μL细胞悬浮液，计数，用完全培养液稀释（使每孔细胞约为4000个，），排枪铺板，边缘孔加PBS，在CO2培养箱中培养24h；
（4）加药：
a).用排枪吸走旧培养液后，加入不同浓度的单鼠李糖脂，分别为100、120、130、140、150μg•mL-1，依据实验需要在37℃，5% CO2培养箱中培养48h，以无细胞的培养液为对照组；
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