四环素对蓝藻藻毒素含量影响的定性研究(7)
蓝藻是由单细胞或许多细胞组成的群体或丝状体。蓝藻毒素大部分存在于细胞内部，当细胞破裂或衰老时就将毒素释放人水体中。蓝藻产生藻毒素的条件主要包括：自然条件下释放藻毒素；受环境胁迫（如温度、PH、微量元素、有毒有害的化学物质等）释放藻毒素；受环境中污染物的影响释放藻毒素。
本实验中以蓝藻为研究对象，研究不同浓度的抗生素对蓝藻毒素含量的影响，探索四环素类抗生素水生环境的安全性。为四环素的合理使用，评价其生态风险，减少环境毒害提供理论依据。因此，选用淡水藻中的蓝藻为研究对象，探索四环素的水生环境的安全性具有重要的意义。
2.2 实验材料与方法
2.2.1 实验蓝藻的培养
本次实验中所用的藻类种源通过购买获得。蓝藻的培养过程包括：仪器的清洗、灭菌、干燥，培养液的制备，蓝藻的接种，蓝藻的培养四个步骤。
（1）仪器的清洗、灭菌、干燥
将玻璃仪器清洗干净后，放入立式蒸汽灭菌器中在121°C，0.1兆帕的条件下进行灭菌处理30分钟。灭菌结束后，待压力降为零后将仪器取出，放入电热鼓风干燥箱中在70°C的条件下进行干燥处理2小时。不耐高温的容器和工具，如塑料和橡胶制品等不能用加热法消毒，则将其放入75%的乙醇溶液中浸泡进行灭菌，实验之前将其取出用蒸馏水冲洗后，再用吸水纸吸干。
（2）培养液的制备
藻的培养液（液体培养基）是在纯净水中加入各种营养物质配制而成。本实验以普通铜绿微囊藻为研究对象，培养基为BG11培养基，培养基成分(配1000ml)如下：
NaNO3 1.5 g/L
K2HPO4 0.04 g/L
MgSO4•7H2O 0.075 g/L
CaCl2•2H2O 0.036 g/L
Citric acid(柠檬酸) 0.006 g/L
Ferric ammonium citrate(柠檬酸铵盐) 0.006 g/L
EDTA Na2 0.005 g/L
Na2CO3 0.04 g/L
A5 (Trace mental solution) 1mL/L ：
H3BO3 2.86 g/L
MnCl2•4H2O 1.86 g/L
ZnSO4•7H2O 0.22 g/L
Na2MO4•7H2O 0.39 g/L
Co (NO3) 2•7H2O 0.05 g/L
CuSO4•5H2O 0.08 g/L
根据所需取上述营养物质加入纯净水，配制成所需的培养液。若其中的固体物质较难溶解，则需放入超声仪中进行超声。待固体完全溶解后，再进行灭菌处理，备用。
（3）藻类接种
培养液配好后进行接种培养。接种就是把藻原液接入新配好的培养液中。
1．藻原液的外观应颜色正常（深绿色）、无大量沉淀和无明显附壁现象。
2．接种前测定藻原液的吸光度，根据藻原液吸光度及实验所需的藻液吸光度确定藻原液的稀释倍数。
3．根据实验所需藻液体积，计算藻原液、培养液及储备液的量。
4．按照培养液，藻原液，储备液的顺序依次将三者加入50ml锥形瓶中。
5．藻液配好后，摇匀测定吸光度，记录开始养藻的时间（一般是上午11点）。
（4）培养
培养环境为SPX-GB-150光照培养箱。培养方法是用50ml锥形瓶，装20~30ml培养液，接种藻液使成淡绿色。四层纱布封口以防污染，温度为25±0.5°C，光照在3000～40001x连续静止培养。经48小时培养后的藻液变为黄色。
2.2.2 实验方案
实验开始时将藻原液接种于50ml锥形瓶中，接种后对其进行一定浓度梯度（0ppm、1ppm、2ppm、5ppm、10ppm）的四环素处理，每个浓度设置3个平行样[39]，配置好的藻液总体积为30ml。然后，利用紫外可见分光光度计测定在680nm处的藻液吸光度。藻液经48小时培养后，再次测试藻液的吸光度，然后利用间接酶联免疫法测定藻液中藻毒素的含量。最终计算出每个试样中藻毒素的总量，单个释放的藻毒素的含量，分析误差棒，进而说明四环素对藻类释放藻毒素的影响及四环素的水生安全性。
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