四环素对蓝藻藻毒素含量影响的定性研究(9)
图3.1 间接法测定抗体示意图
3.3.2 实验操作
(1) 操作流程
(2)样品处理
取1—2ml水样使用0.45μm超滤膜过滤。样品中MC—LR含量可能较高，可适当稀释（用稀释10倍的PBS溶液稀释）。
(3)实验准备
1）浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍，使用前稀释（例如：3ml浓缩洗涤液+57ml蒸馏水,足够24孔使用）
2）抗体（也称第一抗体）配制方法：在使用前，取1瓶抗体（冻干粉），准确加入4.0ml抗体稀释液，混匀，配制成实验用抗体溶液，够48孔反应板使用。
3）酶标二抗配制方法（在临使用前15分钟稀释）：在使用前，取1瓶酶标二抗（冻干粉），准确加入5.5ml抗体稀释液，混匀，配制成实验用酶标二抗溶液。
（4） 实验步骤
1）试剂平衡：将试剂盒取出，放置15分钟以上，平衡至室温。
2）小孔编号：移取所需微孔放置反应板支架上，用洗涤液洗的两次，每次间隔1分钟，拍干.设定1号孔为酶标仪调零孔，2—7号为微囊藻毒素标准对照孔，其余为样品孔。
3）免疫反应：按系列步骤所示，依次加入配制好的溶液及样品液。
第一步：1号孔加入50μL样品稀释液，2—7号孔分别加入50μL系列浓度（0ng/L、100ng/L、250ng/L、500ng/L、1000ng/L、2000ng/L）的标准样品，其余孔加入相应的样品提取液。
第二步：1号孔内加入50μL抗体稀释液，在其它所有微孔中加入50μL第一抗体溶液。
第三步：轻轻振摇，使各孔中反应物混匀。
第四步：37°C，孵育60分钟。
表3.1 反应物组成表
操作次序 加入量 孔号
第一步 50μL 样品稀释液 2 3 4 5 6 7 8—15
第二步 50μL 抗议稀释液 0 100 250 500 1000 2000 样品
第三步 摇匀
第四步 37°C，孵育60分钟
4）洗涤：倒掉板中液体，每孔加入约250μL洗涤液，洗液不得溢出，放置1分钟后，甩掉洗液，在吸水纸上拍干，重复洗涤3次。
5）酶标二抗反应：每孔加入100μL酶标二抗溶液，37°C，孵育30分钟。
6）洗涤：倒掉板中液体，每孔加入约250μL洗涤液，洗液不得溢出，放置1分钟后，甩掉洗液，在吸水纸上拍干，第二次拍干前应更换吸水纸，重复洗涤5次。
7）在每个小孔内加入50μL底物液后，再加入50μL显色液，摇匀，在37°C保温箱中显色15分钟。
8）在每个微孔中加入50μL反应终止液。
9）轻轻摇动微孔板，30分钟内在450nm处读取光密度值（OD值）。
10）结果判定：
以上实验步骤测定的2—15号孔的OD值均减去1号孔的OD值，然后以上述所得的3—7号孔的OD值与2号孔的OD值的比值乘以100作为纵坐标，以标准溶液浓度的对数（lgC）作为横坐标，可以画出一条标准曲线图。
计算样品孔OD值与2号孔OD值的比值，乘以100，差标准曲线，可以得到相应样品浓度的常用对数值lgC，对其求反对数，可求得样品提取液中的微囊藻毒素含量，未获得样品的浓度，度数的浓度必须乘以相应的稀释因子。
X=C×n
X—样品中微囊藻毒素的含量（ng/L）
C—从标准曲线上差得相对应样品浓度（ng/L）
n—样品提取液稀释倍数
3.3.3 剂盒最低检测限、线性范围、变异系数
试剂盒最低检测限：0.05ppb
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