四环素对蓝藻的急性毒性研究+实验讨论(10)
使用血球计数板计数时，先要测定每个中方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
已知：1 cm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000 mm3
所以：0.1 mm3体积应含有中方格数为25，即系数K=2.5×105 。
因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个中格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）。
铜绿微囊藻生物量的测定：通过显微镜下血球计数板进行藻类计数和在波长680nm下测定藻类光密度，建立不同藻类细胞密度和光密度之间线性关系，以计数的藻细胞浓度和光密度表示藻生物量，通过二者线性关系进行检验。
铜绿微囊藻相对增长速率K的计算：
（3-1）
式中K——相对增长率
Nt——处理t时刻的细胞密度(个/ mL)
N0 ——起始密度(个/ mL)，t——培养时间
ρ——生长阻碍率
3.2.2 实验方法
使用血球计数板，计数一定浓度下，藻细胞个数。进行两次实验，第一次试验，将原液分别稀释2倍、5倍、10倍、20倍和50倍，测定各稀释倍数下相应的吸光度，并随机选取25个中格中的5个进行细胞计数，并换算计算藻密度，第二次实验，分别将原藻样稀释20倍、30倍、40倍、50倍、60倍和100倍，测定各稀释倍数下相应的吸光度，并随机选取25个中格中的9个进行细胞计数，并换算计算藻密度。两次实验数据汇总，做出藻样密度和吸光度之间的关系曲线，并线性拟合。
3.3 铜绿微囊藻生长曲线及抑制率
将16个50 mL三角烧瓶分别加入经稀释后的藻液，初始藻密度为1.41×106 个/mL。编号为0～3的4瓶藻样作为控制样参照，不添加抗生素；标号为28～30的，控制四环素浓度为1 mg/L；标号为31～33的，控制四环素浓度为2 mg/L；标号为34～36的，控制四环素浓度为5 mg/L；标号为37～39的，控制四环素浓度为10 mg/L。分别测定24、48、72、96、120、144小时各藻样的吸光度，绘制藻样在控制组和各四环素浓度下的生长曲线，并求EC(50,96h)。
四环素对铜绿微囊藻的抑制率测定生长阻碍率：
（3-2）
式中：K0——空白样吸光度；Kt——t时刻吸光度
图3-1 测定铜绿微囊藻生长曲线实验
3.4 铜绿微囊藻pH变化规律
将16个50 mL三角烧瓶分别加入经稀释后的藻液，初始藻密度为1.41×106 个/mL。编号为0～3的4瓶藻样作为控制样参照，不添加抗生素；标号为4～6的，控制四环素浓度为1 mg/L；标号为7～9的，控制四环素浓度为2 mg/L；标号为10～12的，控制四环素浓度为5 mg/L；标号为13～15的，控制四环素浓度为10 mg/L。测定第0、48、96、144小时各藻样的pH，绘制藻样在控制组和各四环素浓度下的pH变化规律曲线。
3.5 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
3.5.1 实验原理
考马斯亮蓝G-250是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465 nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质——考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移，在595 nm处有最大吸收值。由于蛋白质——考马斯亮蓝复合物在595 nm处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465 nm处的光吸收，因此，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质——考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1 μg左右。
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