四环素对蓝藻的急性毒性研究+实验讨论(9)
灭菌条件为在121C，0.11 MPa下灭菌30分钟，待灭菌锅压力指示为0 MPa时，将灭菌后的培养液取出置于避光处存放。将其余灭菌后的器皿放入电热鼓风干燥箱中，在70C的环境下鼓风干燥2小时。等到需要用时方才取出。本实验所有实验器皿均须灭菌操作。
2.2.3 铜绿微囊藻的接种
铜绿微囊藻FACHB 905购于中国科学院武汉水生所（武汉，中国）。
接种时须满足以下条件：藻种的质量一般要求选取无敌害生物污染、生活力强、生长旺盛的藻种培养，藻液的外观应颜色正常、无大量沉淀和无明显附壁现象；接种的藻液容量和新配培养液量的比例为1:2～1:3；接种的时间最好是在上午的8时～10时，不宜在晚上接种。上午接种可以吸取上浮的运动力强的藻细胞做藻种，弃去底部沉淀的藻细胞，起到择优的作用。
接种时一般选250 mL三角烧瓶接种原藻液50 mL并加入新配培养液100～150 mL或选取500 mL的三角烧瓶接种原藻液100 mL并加入新配培养液250 mL。
2.2.4 铜绿微囊藻的培养
培养环境为SPX-GB150人工智能气候箱。培养方法是使用上述250 mL或500 mL的经过藻液接种的三角烧瓶。三角烧瓶应用四层纱布封口以防污染和倾倒，培养前藻液应当为浅绿色，经过7天的培养，藻液颜色变化为翠绿色。
藻液的培养环境为：温度为25±0.5C，光照在2000～4000 Lx连续静止培养。每天摇动3次。白天黑夜时间比为12h:12h。
2.3 实验方案论证
诸多文献阐明，四环素类抗生素能微生物、植物和动物都会产生影响。四环素类药物对微藻的毒性主要体现在抑制微藻蛋白质合成和叶绿体的生成最终造成对微藻生长的抑制。多项研究表明，四环素类抗生素可能通过抑制叶绿体合酶的活性，从而对植物生长产生抑制作用，影响植物发芽率和根的生长，这与四环素对微藻的毒性研究结果相似。四环素类抗生素能够抑制水生动物多种酶的活性，如乙氧基试卤灵-O-去乙基酶、β-半乳糖苷酶等，并可能造成鱼类较严重的DNA损伤。我们的课题四环素对蓝藻的急性毒性研究在理论上是能够得到支持的。
就技术而言，实验室对本项目开展了前期研究，结果表明本项目在科学上和技术上是可行的。项目采用的实验方法和分析测试技术，都是公开报道经过证实的实验方法与技术，能保证实验结果的准确性和可比性。
在硬件上，学校测试中心拥有本项目所需的大型设备：紫外-可见分光光度计、细胞破碎仪、培养箱、离心机、电子显微镜、灭菌锅等。具备完成本课题所需的吸光度的测定以及生长曲线的绘制、毒理学实验的先进仪器设备和良好工作条件。这些条件为实验的顺利进行奠定了基础。
3. 实验方案与方法
3.1 四环素储备液的配置
使用分析天平秤取0.0100g的四环素，加入经灭菌烘干过的10 mL容量瓶中，并使用1000 μL的移液枪移取10 mL娃哈哈纯净水配置成为浓度为1000 mg/L的四环素储备液10 mL。
3.2 铜绿微囊藻细胞数与吸光度的关系
3.2.1 实验原理
我们采用微生物的光学显微镜直接计数法。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格共计由400个小方格组成。
计数区边长为1 mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400 mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1 mm，所以每个计数区的体积为0.1 mm3，每个小方格的体积为1/4000 mm3。
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