低胆固醇牛奶的研发+实验材料和方法(7)
m——样品质量，单位为克（g）；
m1——测得的脂肪收集瓶和抽提物的质量，单位为克（g）；
m2——脂肪收集瓶的质量，或在有不溶物存在下，测得的脂肪收集瓶和抽提物的质量，单位为克（g）；
m3——空白实验中，测得的脂肪收集瓶和抽提物的质量，单位为克（g）；
m4——空白试验中，脂肪收集瓶的质量，或在有不溶物存在下，测得的脂肪收集瓶和抽提物的质量，单位为克（g）；
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
2.2.2 胆固醇标准曲线的绘制（分光光度法）
根据GB/T5009.128- 2003 ，吸取胆固醇标准使用液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0mL分别于10mL试管中，在各管内加入冰乙酸使体积皆达4mL,沿管壁加入2mL铁矾显色液，混匀，在15min～90min内，在560nm～575nm波长在比色。以胆固醇标准浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标做标准曲线。
2.2.3 牛奶中的胆固醇含量的测定(分光光度法)
（1）吸取所抽提的油脂3~4滴（准确称量其质量，精确至0.0001g）于小锥形瓶中内→加入4mL无水乙醇，0.5mL500g/L的氢氧化钾溶液→65℃水浴中皂化1h,（皂化时每隔20~30min取出振荡一次）→皂化完毕，取出试管，冷却→加入3mL50g/L氯化钠溶液，10mL石油醚，→手动振摇2min→静置分层（1h左右）→吸取上层石油醚2mL于10mL具塞试管中，65℃水浴蒸干→加入4mL冰乙酸，2mL铁矾显色剂，混匀→放置15min后在560~575nm波长下比色，测吸光度。
（2） 在相应的胆固醇标准曲线上查找胆固醇的含量。
（3） 计算：X= * 式中：
X——试样中胆固醇含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；
V1——石油醚的总体积，单位为毫升（mL）；
V2——取出的石油醚体积，单位为毫升（mL）；
m——称取食品的油脂试样量，单位为克（g）；
c——试样中的油脂含量，单位为克每百克（g/100g）；
——折算成每100克试样中胆固醇的毫克数；
测定结果表示到小数点后一位。
2.2.4 胆固醇标准曲线的绘制（高效液相色谱法）
色谱参考条件：色谱柱：C18反相色谱柱（4.6mm*150mm,5μm）；柱温：38℃；流动相：甲醇；流速：1.0mL/min；测定波长：205nm；进样量：10μL
分别取10μL标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值（峰面积），以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
2.2.5 牛奶中胆固醇含量的测定（高效液相色谱法）
称取样品10g于250mL平底烧瓶中→加入30mL无水乙醇、10mL60%氢氧化钾溶液→100℃磁力搅拌加热电热套回流1h→5mL无水乙醇冲洗内部→冷却、定量转移皂化液于分液漏斗中→30mL蒸馏水分2～3次冲洗烧瓶→并入分液漏斗中→振摇2min→静置分层→转移水相于第二个分液漏斗中→洗涤提取液至中性→提取液通过10g无水碳酸钠脱水→转移至150mL平底烧瓶中
将上述平底烧瓶的提取液在真空条件下蒸发→无水乙醇溶解定容至5mL→收集清液于进样瓶→待色谱仪测定→计算结果
计算： X= *100
式中：
X——样品中的胆固醇含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；
C——样液中的胆固醇含量，单位为毫克每毫升（mg/mL）；
V——定容体积，单位为毫升（mL）；
m——样品质量，单位为克（g）；
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