金霉素对蓝藻的急性毒性研究(7)
(4) 培养
培养环境为SPX-GB-150恒温光照培养箱。培养方法是用500 mL三角瓶，装200~400 mL培养液，接种藻种使成淡绿色。四层纱布封口以防污染，温度为25±0.5 °C，光照周期为光照12h、黑暗12h，光照在3000~4000 1x连续静止培养，。每天摇动1~2次，经几天培养后藻液变为深绿色。实验开始时稀释藻液，并用紫外分光光度计测定其吸光度，待测到我们所需的吸光度，记录其稀释倍数。然后将稀释后的藻液移于50 mL三角锥形瓶中，藻液总体积为50 mL，对其进行一定浓度梯度的金霉素投加，每个浓度设置3个平行样。
2.3 实验方案
2.3.1 藻的生长曲线
将27个50 mL三角烧瓶分别加入经稀释后的藻液，藻样的初始吸光度为0.065 Abs。编号为0~2的3瓶藻样作为控制样参照，不添加抗生素；标号为3~5的，控制投加的金霉素浓度为1 ppm；标号为6~8的，控制金霉素浓度为2 ppm；标号为9~11的，控制金霉素浓度为5 ppm；标号为12~14的，控制金霉素浓度为10 ppm；标号为15~17的，控制金霉素浓度为15ppm；标号为18~20的，控制金霉素浓度为20 ppm；标号为21~23的，控制金霉素浓度为25 ppm；标号为24~26的，控制金霉素浓度为30 ppm。分别测定24、48、72、96、120、144小时各藻样的吸光度，并绘制藻样在控制组和金霉素浓度下的Logistic拟合生长曲线；求其抑制率，做出抑制率柱状图，并求EC(50,96h)。
2.3.2 测定藻液生物量
使用血球计数板，计数一定浓度下，藻细胞个数。进行两次实验，第一次试验，将原藻样分别稀释2倍、5倍、10倍、20倍和50倍，测定各稀释倍数下相应的吸光度，并随机选取25个中格中的5个进行细胞计数，并换算计算藻密度，第二次实验，分别将原藻样稀释20倍、30倍、40倍、50倍、60倍和100倍，测定各稀释倍数下相应的吸光度，并随机选取25个中格中的9个进行细胞计数，并换算计算藻密度。两次实验数据汇总，做出藻样密度和吸光度之间的线性拟合关系曲线。
2.3.3 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
考马斯亮蓝G-250 在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595 nm处比色测定。2-5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.01~1.0 mg蛋白质/ mL范围均可。
首先绘制标准曲线。取7支试管，加入0.5 mg/mL牛血清蛋白0 mL，0.1 mL，0.2 mL， 0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1 mL，加入蒸馏水使总体积为1 mL，再加5 mL考马斯亮蓝试剂至各个试管。摇匀后静置20分钟后，马上用分光光度计比色测定吸光值A595nm。以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，并绘制其标准曲线。
再测定藻液样品。将10个100 mL三角烧瓶分别加入经稀释后的藻液。编号为1和2的两瓶藻样作为控制样参照。标号为3和4的，控制金霉素浓度为1 ppm；标号为5~7的，控制金霉素浓度为10 ppm；标号为8~10的，控制金霉素浓度为20 ppm。分别测定24、72、120小时吸光度。测定吸光度时，先从100mL三角烧瓶中取出30 mL，移至烧杯，在细胞破碎仪下破碎20分钟（破碎3秒，停3秒），随后取经破碎的藻液于离心机下离心两分钟（3000 r/m），取离心后上清液1 mL于10 mL试管中加入5 mL考马斯亮蓝，震荡均匀，并静置20分钟，随后在595 nm下测定吸光度。对照标准曲线求得蛋白质的浓度。
2.3.4 pH测定
分别在0，48h，72h，96h，144h后对3个空白样以及7个浓度梯度（1 ppm，2 ppm，5 ppm，10 ppm，15 ppm，20 ppm，25 ppm，30 ppm）的三个平行样测其pH，做出pH与金霉素浓度和时间的柱状关系图。pH同水体中铜绿微囊藻的繁殖和光合作用消耗水中二氧化碳等因素以及金霉素对铜绿微囊藻的毒性效应有关。
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