金霉素对蓝藻的急性毒性研究(9)
( 1 ) 配置考马斯亮蓝试剂
取考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇，加入100 mL 85%磷酸，加水稀释至一升，摇匀。
( 2 ) 绘制标准曲线。
取7支试管，分别加入0.5 mg/mL牛血清蛋白0 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1 mL，加入蒸馏水使溶液总体积为1 mL，再加5 mL考马斯亮蓝试剂至各个试管。摇匀后静置20分钟。用分光光度计比色在595 nm时测定吸光值A595nm。以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
( 3 ) 测定样品。
将10个100 mL三角烧瓶分别加入经稀释后的藻液90 mL。编号为1和2的2瓶藻样作为空白样参照。标号为3和4的，控制金霉素浓度为1ppm；标号为5-7的，控制金霉素浓度为10ppm；标号为8-10的，控制金霉素浓度为20ppm。分别测定24、72、120时的吸光度。测定吸光度前，先从100mL三角烧瓶中取出30mL样液，移至50mL烧杯内，放在细胞破碎仪下破碎20分钟（破碎3秒，停3秒），随后取经破碎的藻液于离心机下离心2分钟(离心机设定转速为3000r/m)，取离心后上清液1mL于10mL试管中，加入5mL考马斯亮蓝溶液，摇晃均匀，并静置20分钟，随后在595nm下测定吸光度。对照标准曲线求得蛋白质的浓度。
3.3 pH的测定
分别在0、48h、72h、96h、144h后对4个空白样以及4个浓度梯度的三个平行样测定pH值，pH同水体中蓝藻的繁殖和光合作用消耗水中二氧化碳等因素有关。
4 结果与讨论
4.1 显微镜计数与吸光度之间的线性关系
通过显微镜计数并在680 nm处测定吸光度，建立不同藻细胞浓度下的藻细胞数量与光密度之间的线性关系，具有良好的相关度，铜绿微囊藻y=238.67x-2.0454，R2=0.9992，见图一。
图2 显微镜计数与吸光度的线性关系
4.2 生长曲线与抑制率
在以上的基础上，我们通过测定吸光度来描绘以不同浓度的金霉素处理的铜绿微囊藻样品的生长曲线，该生长曲线见图2。
抑制率直接采用（对照吸光度-处理吸光度）/对照吸光度计算，做出各个时期各个浓度的抑制率后，我们能做出其抑制率随时间和浓度变化的柱状关系图，这让我们能更形象直观的看出金霉素对藻细胞生长情况的影响。
4.2.1 生长曲线
图3 加入不同浓度金霉素的铜绿微囊藻的Logistic拟合生长曲线
表3 加入不同浓度金霉素的铜绿微囊藻生长曲线Logistic拟合公式
浓度 对应公式 浓度 对应公式
由图3可以看出，不同浓度的金霉素在不同时期对铜绿微囊藻产生不同影响。除25 ppm、30 ppm三个加入高浓度金霉素的样液，因金霉素浓度过高导致铜绿微囊藻从一开始就死亡，导致其生长曲线在各个时期都持平外，在1 ppm金霉素浓度时，铜绿微囊藻的生长始终与空白样趋近，说明此浓度的金霉素对铜绿微囊藻生长近乎无影响。加入2 ppm和5 ppm浓度的金霉素的样液与空白样的生长情况基本一致，而加入10 ppm、15 ppm和20 ppm浓度金霉素的样液均比空白样生长缓慢，且由图加入各个浓度金霉素的样液的生长趋势可以看出，金霉素浓度越高，生长曲线越是平缓，说明蓝藻生长越缓慢；此外，在第0天到第1天之间，有加入若干浓度金霉素的藻液样品的藻细胞生长速度在空白样之上，由此可知，这几个浓度的金霉素对藻细胞的生长起了促进作用。而随着时间的增长，加入金霉素的藻液的藻细胞生长情况开始渐渐落后于空白样中的藻细胞，这显示了金霉素开始发挥其毒性效果。
4.2.2 抑制率
由于20 ppm、25 ppm、30 ppm的3组样品中蓝藻一开始就基本死亡，故此三组数据不具参考性，忽略不计。
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