金霉素对蓝藻的急性毒性研究(8)
3 实验部分
3.1 藻体生物量与抑制率测定
3.1.1 藻体生物量测定
测定蓝藻的生物量，首先采用显微直接计数法[21]在血球计数板上直接数藻细胞的数量。
血球计数板是一块特质的厚型载玻片，载玻片上有4条草构成3个区域。中间的区域较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
使用时，取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片，将待测液用玻璃毛细管吸取少许，从计数板中间区域2侧的沟槽内沿盖玻片下边缘滴入一小滴，等待液体充满计数区后，置于显微镜上计数。
血球计数板计数区边长为1 mm，则计数区的面积为1 mm2 ，每个小方格的面积为1/400 mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1 mm，所以每个计数区的体积为0.1 mm3，每个小方格的体积为1/4000 mm3。
使用血球计数板计数时，先测定每个小方格中藻细胞的数量，再换算成每毫升菌液中藻细胞的数量。
已知：1 cm3体积=1000 mm3
所以：1 cm3体积应含有小方格数为1000 mm3/ 1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K= 4×106。
每mL菌悬液中含有细胞数=每个小格中细胞平均数N×系数K×菌液稀释倍数d ( 1 )
然后，在波长680nm下测定各个样液的吸光度，通过显微镜下血球计数板进行藻类计数和在波长680nm下测定藻类光密度，建立不同藻类细胞密度和光密度之间线性关系，以计数的藻细胞浓度和光密度表示藻生物量，通过二者线性关系进行检验。
铜绿微囊藻相对增长速率K的计算： K = ( 1nNt -1nN0 ) / t ( 2 )
式中：K —相对增长率
Nt —处理t时刻的细胞密度（个/ mL）
N0 —起始密度（个/ mL）
t —培养时间
3.1.2 藻体抑制率测定
藻体接种于50 mL三角锥形瓶中，每个浓度设置三个平行，分别于培养24，48，72，96，120，144，168 h后，通过生长阻碍率的计算得出生长抑制率。紫外光谱扫描波长范围为600~700 nm，记录684 nm处的吸光度值。
生长阻碍率： ( 3 )
式中：K0 —空白样吸光度
Kt — t 时刻吸光度
3.2 蛋白含量测定
本次实验，使用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量。
考马斯亮蓝G-250 在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595 nm处比色测定。2~5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.01~1.0 mg蛋白质/ mL范围内均可。
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